参考数据库选择影响丛枝菌根真菌群落的分类注释与生态推断

《Journal of Fungi》：Reference Database Selection Influences Both Taxonomic Annotation and Ecological Inference in Arbuscular Mycorrhizal Fungal Communities

　　

摘要专业翻译 丛枝菌根（AM）真菌是土壤生态系统中的关键微生物，其群落组成在调控生态系统功能方面发挥着至关重要的作用。尽管高通量测序被广泛用于表征其群落，但用于序列注释的参考数据库选择仍缺乏一致性。为在物种水平评估数据库性能，研究人员对四种具有对比群落特征的植物物种的根际土壤和根系样本进行了扩增子测序。研究人员比较了使用MaarjAM、SILVA和NCBI数据库生成的分类注释结果。NCBI提供了最高的分类分辨率，鉴定出18个属和108个种，包括Rhizophagus intraradices和Funneliformis mosseae，其分类指派得到孢子分离和命名学验证的支持。相比之下，MaarjAM恢复了最多的ASV，但包含大量虚拟分类单元（virtual taxa），而SILVA则表现出有限的注释深度和最少的分类指派数量。比较分析表明，NCBI在基于α多样性和群落结构区分样本方面更为敏感，并产生了与生态预期更为一致的物种分布。尽管核心代谢谱在各数据库间保持保守（这可能表明存在功能冗余，从而有助于生态系统稳定性），但数据库选择影响了环境变量与群落之间关系解读。总体而言，研究人员推荐将NCBI用于物种水平注释和群落分析，而不恰当的数据库选择可能导致生物多样性评估和生态推断产生偏差。

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一、研究背景与科学问题

丛枝菌根（AM）真菌是一类与绝大多数陆生维管植物形成共生关系的关键土壤微生物，在促进宿主植物对矿质养分（尤其是磷）和水分吸收、增强植物对生物与非生物胁迫的耐受性、改善土壤理化性质以及维持生态系统稳定性等方面发挥着不可替代的作用。在自然生态系统中，AM真菌并非以孤立物种形式存在，而是以复杂群落的形式定殖于植物根系并持续存在于根际土壤中，群落内部成员之间的竞争与合作关系深刻影响着群落功能的发挥。因此，准确表征AM真菌群落的物种组成和动态变化，对于理解其生态功能至关重要。

传统的基于孢子形态特征的鉴定方法受限于培养困难、形态特征有限以及采样深度不足等瓶颈，难以准确反映环境样本中的真实群落组成。尽管末端限制性片段长度多态性（T-RFLP）技术部分弥补了这些不足，但相同长度片段的共迁移现象仍会显著低估物种多样性。近年来，高通量测序技术的进步使得直接从环境样本中扩增并大规模测序AM真菌标记基因成为可能，为AM真菌生态学和物种多样性的精细研究提供了灵敏且高分辨率的技术手段。

然而，高通量测序分析结果强烈受方法学选择的影响，其中分子标记和参考数据库的选择尤为关键。在多种遗传标记中，SSU rRNA区域因其在序列保守性、分类分辨率、数据库可用性和技术可行性之间提供了良好平衡，已成为AM真菌群落研究中最常用的靶标之一。参考数据库选择是影响群落分析的另一个关键因素，但目前针对数据库性能的系统比较研究仍然匮乏。MaarjAM数据库专为AM真菌开发，提供精心整理的参考序列，但其分类覆盖范围相对有限；SILVA数据库涵盖广泛的真核生物SSU rRNA序列，覆盖全面但针对AM真菌的分类分辨率不足；NCBI作为综合性序列存储库，数据量最大，但沉积序列的质量异质性可能给分类指派带来不确定性。鉴于三种数据库在序列来源和注释标准上的差异，数据库选择可能显著影响分析结果。因此，系统评估各数据库的性能与局限性，尤其是在物种水平注释可靠性和对群落分析及生态解释的下游影响方面，具有重要的科学意义。

基于上述背景，该研究提出两个核心假设：（1）分类覆盖范围更广的数据库（尤其是NCBI）将提供更高的物种水平分类分辨率和更强的AM真菌群落组成表征灵敏度；（2）由于分类指派的差异，不同数据库衍生的预测功能谱和环境因子与AM真菌群落组成之间关系的推断将存在差异。

二、研究设计与主要技术方法

研究人员在欧亚大陆东部的松嫩草原（46°04′–46°46′ N，125°37′–125°88′ E）选取了四种代表不同生态位的AM真菌宿主植物——千屈菜（Lythrum salicaria）、紫花苜蓿（Medicago sativa）、旋覆花（Inula japonica）和蒲公英（Taraxacum mongolicum）。每种植物设置三个样地（样地间距≥50 m），每个样地采用五点采样法采集0–30 cm土层含细根的土芯，共获得12个根样本和12个根际土壤样本。

主要技术方法包括：对24个样本提取DNA后，使用引物对AMV4.5NF/AMDGR扩增AM真菌SSU rRNA区域约280 bp片段，在Illumina NovaSeq平台（PE250）上进行双端测序；利用QIIME 2（版本2024.5）中的DADA2插件进行引物去除、质量控制、去噪、读段合并和嵌合体消除，生成扩增子序列变异体（ASV）表；分别使用MaarjAM 2019-10、SILVA release 138.1和NCBI nt三个参考数据库，通过classify-sklearn算法（置信度阈值0.7）进行分类注释；通过MycoBank查询物种名称的命名学有效性，并采用湿筛倾析法提取孢子进行形态学鉴定以独立验证物种存在性；测定土壤盐碱度（pH、电导率EC、碳酸根、碳酸氢根）、养分状况（有机质SOM、全氮TN、全磷TP）、物理性质（含水量、黏粒含量、水稳性团聚体比例）和酶活性（蔗糖酶、脲酶、过氧化氢酶、碱性磷酸酶ALP）等环境变量；采用PICRUSt2（版本2.2.2-b）基于MetaCyc数据库进行功能通路预测；运用NMDS排序、随机森林分析、生态位宽度计算、方差分解分析（VPA）和Mantel检验等进行统计与生态学分析。

三、研究结果

3.1 四种植物生长位点的土壤条件

四种植物根际土壤性质存在显著差异。紫花苜蓿根际土壤的有机质（78.65 g·kg^-1）和全氮（2.03 g·kg^-1）含量最高，水稳性团聚体比例（52.90%）也显著高于其他物种，这与其豆科固氮能力和根系分泌物改善土壤结构有关。旋覆花根际土壤的pH（8.06）、电导率（0.19）、碳酸根（0.25）和碳酸氢根（0.58）均最高，含水量（9.22%）和黏粒含量也最高，呈现相对盐渍化特征。千屈菜根际土壤有机质含量较低，酶活性普遍偏低，与湿地生态系统有机质周转较快一致。蒲公英根际土壤碱性磷酸酶活性（2.74 mg·g^-1·d^-1）较高。这些土壤差异表明所选植物代表不同的生态位，为评估参考数据库选择对AM真菌群落与环境因子关系解读的影响提供了环境梯度基础。

3.2 序列数据处理与分类指派

三种数据库的分类注释结果差异显著。MaarjAM恢复了最多的AM真菌序列数（63,040条）和ASV数（7,933个），NCBI次之，SILVA最低。在属水平上，NCBI注释出18个属，均为具有实际应用价值的正式分类单元，包括Entrophospora、Scutellospora和Sclerocystis等9个该数据库独有鉴定的属；SILVA和MaarjAM各注释出15个属，但许多指派缺乏正式分类身份，以虚拟分类单元表示。在物种水平上，NCBI鉴定出108个种，其中31个为具有实际应用价值的正式命名种（如Rhizophagus intraradices和Funneliformis mosseae）；MaarjAM虽鉴定出114个种，但仅有2个为正式命名种；SILVA的物种水平指派数量最少。

可靠性分析显示，MaarjAM有81.57%的物种水平指派归属于Glomus属，且两个正式命名种均与现行命名法不一致；SILVA中Entrophospora基于过时的分类框架被指派为Claroideoglomus，不准确物种名称比例达33.33%；NCBI有80.65%的物种名称与现行命名法一致。孢子形态学鉴定进一步验证了数据库注释：SILVA独有的Archaeospora schenckii未在回收孢子中检出，而其他数据库鉴定的大部分物种均得到孢子形态观察支持。形态学鉴定估计的总物种丰富度约110个分类单元，与MaarjAM和NCBI推断的物种丰富度大致一致。总体而言，NCBI具有最高比例的有效分类注释和最高的物种水平分辨率。

3.3 基于不同数据库注释的AM真菌群落α多样性

单因素方差分析显示，MaarjAM注释能区分部分多样性指数的组间差异；SILVA注释产生的多样性估计值普遍较低，样本间变异较小，检测群落差异的能力有限；NCBI注释揭示了更高的多样性水平，并在多个多样性指数上表现出更强的样本区分能力。重复测量方差分析表明，MaarjAM与NCBI在Chao1（Cohen's d = -0.18）和Simpson（Cohen's d = -0.58）指数上无显著差异，但SILVA与NCBI在所有四个多样性指数上均存在显著差异，与MaarjAM在三个指数上存在显著差异。这表明数据库依赖的物种注释会影响α多样性评估，NCBI具有更强的样本表征判别力，而SILVA分辨群落差异的能力相对有限。

3.4 不同数据库下的AM真菌群落结构

NMDS排序分析显示，三种数据库衍生的数据集均具有可接受的排序可靠性（stress < 0.2，R² > 0.6，p = 0.001），但分辨样本间群落组成差异的能力不同。MaarjAM和SILVA注释下样本间存在大量重叠，而NCBI注释提供了更清晰的样本类型分离。Venn分析显示，MaarjAM注释下有28个独有AM真菌物种，NCBI注释下增至38个，表明不同数据库识别稀有和样本特异性分类单元的能力存在差异。随机森林分析表明，MaarjAM鉴定的排名靠前物种主要归属于Glomus属且均为虚拟分类单元，生态可解释性有限；NCBI鉴定了三个具有生态学意义的关键物种，包括Paraglomus occultum、Funneliformis mosseae和Diversispora aurantia。NCBI凭借其优越的分类注释性能，表现出更强的AM真菌群落结构分辨能力和生态学意义分类单元识别能力。

3.5 不同数据库注释下的生态位分化与功能通路

基于生态位宽度值将分类单元划分为特化种（<1）、泛化种（>3）和中性种（1–3）。MaarjAM和SILVA数据库的分析结果在部分样本中偏离理论预期，表现为中性种比例降低，如MaarjAM注释下蒲公英根系和根际土壤中的中性种仅分别占3.16%和33.33%。NCBI注释在所有样本中均呈现更符合生态预期的分布模式——中性种占主导，特化种和泛化种占较小比例，且样本类型间保持更清晰的定量差异。

功能通路预测方面，虽然三种数据库在通路丰度上存在差异（MaarjAM整体值较高），但核心代谢框架高度保守。丰度最高的17条通路在所有数据库衍生的数据集中均被一致鉴定，且各通路相对比例相似，其中生物合成类别中的核苷酸和核苷生物合成通路在所有数据集中均为主导通路。这表明三种数据库在表征AM真菌群落核心代谢潜力方面表现相当，功能保守性可能反映群落内的功能冗余。

3.6 土壤因子与不同数据库注释AM真菌的关系

土壤环境变量的降维分析显示，土壤盐碱化、养分累积、物理性质和酶活性四类变量的累计解释方差分别达83.7%、92.42%、83.01%和92.94%，适合后续分析。方差分解分析（VPA）显示，四类环境因子在MaarjAM、SILVA和NCBI注释下分别解释了AM真菌群落变异的74%、69%和63%，所有环境变量的联合效应在各数据库中贡献最大，其次是土壤盐碱化与酶活性的交互效应。

Mantel检验揭示了三种数据库间AM真菌群落与土壤因子关联模式的差异。pH、碳酸根浓度和全磷与任何数据库衍生的群落均无显著相关；电导率、碳酸氢根浓度、黏粒含量和碱性磷酸酶与所有三个数据集均显著相关，表明这些环境因子可能是AM真菌群落组成的相对稳定驱动因子。其余环境变量的关联呈现明显的数据库依赖性：MaarjAM衍生的群落与任何土壤养分参数均无显著关联；NCBI仅与有机质显著关联；SILVA与有机质和全氮均显著关联；过氧化氢酶活性仅与NCBI数据集显著相关；SILVA与所有土壤物理指标均显著相关。

四、讨论与结论

讨论部分指出，NCBI数据库凭借其全面的序列覆盖范围，在属和物种水平均实现了最高的分类分辨率，成功鉴定了具有明确生态功能的物种，且除Geosiphon pyriformis（Glomeromycota内不建立植物共生关系的独特谱系）外，其余30个NCBI注释的生态相关物种均通过孢子分离获得回收，分子与形态学证据的一致性支持了NCBI注释在生态研究中的潜在价值。MaarjAM数据库虽恢复了最多的序列和ASV，但可生态解释的分类单元比例有限，且存在显著的Glomus属分类偏差，这源于其早期分类框架中将大多数产生“Glomus样”孢子的物种归入广义Glomus谱系。SILVA作为通用rRNA数据库，对AM真菌的物种水平注释深度有限，这与AM真菌高质量参考序列不足和分类历史复杂有关。

数据库间的性能差异同样反映在α多样性指数、NMDS排序和Venn分析中。NCBI在物种检测和分类指派上的优势转化为更强的样本分辨能力和更符合生态预期的生态位分布模式，而MaarjAM和SILVA在多个样本中表现出明显偏差。功能通路预测方面，尽管通路丰度存在差异，但核心代谢框架高度保守，支持微生物基础代谢功能在分类组合间显著保守的已有证据，这种保守性可能指示AM真菌群落内的功能冗余，有助于生态系统稳定性。环境关联分析中，电导率、碳酸氢根浓度、黏粒含量和碱性磷酸酶被所有数据库一致鉴定为AM真菌群落的稳定驱动因子，而其他环境变量的关联呈现数据库依赖性，不恰当的数据库选择可能影响特定生态驱动因子的识别。

研究结论为：NCBI在物种水平分析中提供了更高的物种分辨率，并在多样性估计、样本区分、物种筛选和生态位分析方面表现出优势，推荐用于AM真菌物种水平注释和群落分析，但注释结果应通过MycoBank进行验证；MaarjAM在AM真菌序列检测和ASV水平表征方面仍有价值，适用于以群落α多样性为重点的研究；SILVA因物种水平分辨率较低而应用受限，但其衍生的群落数据集仍能捕捉环境关联并维持相对稳定的核心功能预测。未来研究应整合多个数据库的优势，开发兼具广泛AM真菌序列覆盖和高分类准确性的参考资源，以改进AM真菌群落的物种鉴定和生态解释。