《Current Issues in Molecular Biology》：Genomic Characterization and Biotechnological Potential of a Skatole-Degrading Bacillus pumilus Strain hhy901 Isolated from Bovine Manure
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粪臭素（3-甲基吲哚）是畜禽粪便中排放的主要恶臭化合物，对集约化畜牧生产中的臭味控制构成重大挑战。本研究从新鲜牛粪中分离出一株粪臭素降解菌株，命名为hhy901，并通过多相分类学方法（包括16S rRNA和gyrB基因系统发育分析、形态学特征、生化特性分析及全
粪臭素（3-甲基吲哚）是畜禽粪便中排放的主要恶臭化合物，对集约化畜牧生产中的臭味控制构成重大挑战。本研究从新鲜牛粪中分离出一株粪臭素降解菌株，命名为hhy901，并通过多相分类学方法（包括16S rRNA和gyrB基因系统发育分析、形态学特征、生化特性分析及全细胞脂肪酸分析）将其鉴定为短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）。在芽孢杆菌液体培养基中，初始粪臭素浓度为100 mg/L的条件下，菌株hhy901在96 h内去除了87.2%的粪臭素（采用高效液相色谱法（HPLC）测定）。全基因组测序结果显示，该菌株基因组大小约为3.60 Mb，GC含量为41.91%，编码3564个预测蛋白质编码基因。功能基因组注释鉴定出39个与外源化合物生物降解和代谢相关的基因，包括推定的儿茶酚双加氧酶、醛脱氢酶和细胞色素P450基因，这些基因共同提示了一条潜在的粪臭素分解代谢途径。此外，该基因组还携带了大量与重金属、消毒剂及多种抗生素类别抗性相关的基因，表明其具有环境胁迫适应的潜力。毒力因子分析主要鉴定出与营养获取和微生物竞争相关的基因，仅检测到1个与侵袭相关的因子，提示其侵袭性致病潜力相对较低。然而，多种 antimicrobial resistance determinants（抗菌药物耐药决定因子）的存在仍需谨慎解读，在环境应用前必须对降解功能和生物安全性进行表型验证。上述结果确立了短小芽孢杆菌hhy901作为进一步开发畜禽生产生物脱臭策略的有前景的微生物候选菌株，但仍有待功能和安全性验证。
论文解读文章
一、研究背景与研究意义
粪臭素（3-甲基吲哚）是畜禽粪便中最具代表性的吲哚类恶臭物质，由肠道微生物群对色氨酸的厌氧代谢产生。由于其极低的嗅觉阈值和持久的恶臭特性，粪臭素已成为畜禽养殖臭味控制的核心目标污染物。传统的物理吸附和化学氧化等脱臭方法往往存在运行成本高、易产生二次污染等问题。相比之下，微生物降解因其环境友好、成本低廉且可原位修复，已成为畜禽粪便臭味缓解的主流技术路径。因此，分离具有高效粪臭素降解功能的功能菌株，是实际应用该生物技术的关键前提。
已有文献报道了从畜禽粪便、瘤胃液、活性污泥和污染土壤等多种环境基质中分离出的粪臭素降解微生物，涵盖假单胞菌属（Pseudomonas）、不动杆菌属（Acinetobacter）、鞘氨醇杆菌属（Sphingobacterium）、乳杆菌属（Lactobacillus）和芽孢杆菌属（Bacillus）等。其中，芽孢杆菌属菌株因其能形成内生孢子而备受关注，这赋予其卓越的耐热、耐干燥和环境胁迫耐受能力，对生物接种剂的制剂化和储存极为有利。然而，目前明确表征的具有粪臭素降解能力的芽孢杆菌菌株数量仍然有限，且已报道菌株的降解效率相对较低。例如，Wang等人从牛瘤胃中分离的芽孢杆菌菌株在48 h内对100 mg/L粪臭素的降解率仅为23.03%；Xu等人从鸡粪中筛选的芽孢杆菌分离株在24 h内对10 mg/L粪臭素的去除率为44.5%。此外，畜禽粪便中残留的重金属、兽用抗生素和消毒剂会严重抑制降解菌的存活和功能，因此分离兼具高效降解能力和广谱胁迫抗性的本土菌株对粪便环境的实际应用至关重要。
短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）作为芽孢杆菌属的典型物种，此前已被广泛研究其在促进植物生长和病害拮抗方面的作用，但其在环境生物修复——特别是吲哚类恶臭物质降解方面的潜力尚未得到充分探索。基于此，本研究旨在从牛粪中分离并鉴定一株具有高效粪臭素降解能力的短小芽孢杆菌菌株，通过全基因组测序和生物信息学注释揭示其降解功能的分子基础和环境适应机制，评估其作为畜禽粪便生物脱臭微生物资源的应用潜力。
二、主要技术方法
研究人员从中国昌吉采集新鲜牛粪样品，经无菌生理盐水悬浮、系列稀释后涂布于含100 mg/L粪臭素的芽孢杆菌选择性琼脂平板，分离纯化获得候选菌株。菌株鉴定采用多相分类学方法，包括16S rRNA和gyrB基因扩增测序及系统发育分析、形态学和染色特征观察、API 50CH碳源利用试验、全细胞脂肪酸分析（MIDI Sherlock系统），并辅以基于全基因组的平均核苷酸一致性（ANI）和数字DNA-DNA杂交（dDDH）分析。粪臭素降解效率通过高效液相色谱法（HPLC）测定，以2-甲基吲哚为内标进行定量。全基因组测序采用PacBio和Illumina联合测序策略，分别使用Flye v2.9.2和Pilon进行组装和校正，基因预测使用Prodigal，功能注释通过BLASTP比对NR、Swiss-Prot、Pfam、COG、KEGG和GO数据库完成。抗生素抗性基因通过CARD和ResFinder数据库鉴定，重金属和消毒剂抗性基因通过BacMet数据库注释，毒力因子通过VFDB数据库搜索，移动遗传元件通过Majorbio云平台预测。
三、研究结果
3.1 菌株hhy901的多相分类鉴定
菌株hhy901的16S rRNA基因序列长度为1451 bp，与短小芽孢杆菌模式菌株ATCC 7061T的相似性最高（99.93%）。gyrB基因片段长度为1136 bp，与短小芽孢杆菌ATCC 7061T的相似性为97.50%，系统发育树以100%自展值支持其与短小芽孢杆菌的聚类关系。形态学上，该菌株在TSA培养基上形成圆形、凸起、边缘皱褶的菌落，革兰氏阳性、杆状，可形成端生或次端生内生孢子。全基因组ANI分析显示菌株hhy901与短小芽孢杆菌ATCC 7061T的ANI值为95.73%，超过95%的物种界定阈值；dDDH分析d4值为64.3%，低于70%的物种阈值，但GBDP系统发育树将其稳定地置于短小芽孢杆菌分支内。综合多相分类学证据和基因组数据，菌株hhy901被鉴定为短小芽孢杆菌，但在种内基因组位置上相对分化。
3.2 菌株hhy901的生理生化特征
全细胞脂肪酸分析显示，菌株hhy901的主要脂肪酸为C15:0 anteiso（39.72%）、C15:0 iso（29.69%）、C17:0 anteiso（9.23%）和C16:0 iso（8.36%），符合芽孢杆菌属的典型脂肪酸模式。API 50CH碳源利用试验表明，该菌株能利用D-核糖、D-葡萄糖、D-果糖、D-甘露糖、D-甘露醇、熊果苷、七叶灵、水杨苷、D-蔗糖和D-塔格糖，对L-阿拉伯糖、D-木糖、苦杏仁苷、D-纤维二糖、D-海藻糖和龙胆二糖呈弱阳性反应。
3.3 短小芽孢杆菌hhy901的基因组特征
全基因组测序显示，短小芽孢杆菌hhy901的基因组由一条3599,587 bp的环状染色体组成，GC含量为41.91%，未检测到质粒。基因预测共鉴定出3564个蛋白质编码序列。
3.4 短小芽孢杆菌hhy901的功能注释
COG功能分类将预测蛋白归入21个功能类别，其中氨基酸转运与代谢（316个）、转录（306个）、碳水化合物转运与代谢（244个）、翻译/核糖体结构与生物发生（244个）以及一般功能预测（245个）最为丰富。KEGG通路分析将注释基因映射到代谢、细胞过程、遗传信息处理、环境信息处理和生物体系统等主要功能类别，其中碳水化合物代谢、氨基酸代谢和能量代谢相关基因数量最多。GO分析将预测基因分为生物学过程（1336个）、分子功能（2125个）和细胞组分（1081个）三个本体，催化活性和结合是分子功能类别中代表性最高的条目。
3.5 与外源化合物降解、胁迫抗性和生物安全相关的基因
碳水化合物活性酶分析共鉴定出108个编码基因，分属六大类：糖苷水解酶（GHs）36个、碳水化合物酯酶（CEs）32个、糖基转移酶（GTs）29个、辅助活性酶（AAs）7个、多糖裂解酶（PLs）2个和碳水化合物结合模块（CBMs）2个。
KEGG功能注释共鉴定出39个与外源化合物生物降解和代谢相关的基因，分布于芳香族化合物降解的多条通路中。值得注意的是，检测到编码儿茶酚2,3-双加氧酶（C23O，catE）的基因，该酶催化儿茶酚的2,3-位间位裂解，是包括吲哚类污染物在内的芳香族化合物好氧降解的关键酶。此外还注释到2-羟粘康酸半醛水解酶（dmpD）、4-羧基粘康酸内酯脱羧酶（pcaC）、4-草酰巴豆酸互变异构酶（praC）以及苯乙酸降解通路关键基因（paaH、atoB、atoD、atoA）。基因组还携带3个醛脱氢酶基因（ALDH）拷贝、1个单胺氧化酶基因（aofH）、细胞色素P450基因（cypD_E）、硝基还原酶家族基因（nfsA、nfnB、nbaA）和N-乙基马来酰亚胺还原酶基因（nemA）等氧化还原酶系统基因。
BacMet数据库筛选结果显示，基因组携带大量重金属抗性相关基因，其中镍（Ni）抗性相关基因最多（59个拷贝），其次为钨（W）（44个）、锌（Zn）（30个）、钴（Co）（29个）和铜（Cu）（29个）。砷（As）抗性由22个基因代表。还鉴定出37个溴化乙锭抗性相关基因、21个过氧化氢抗性相关基因，以及针对苯扎氯铵（BAC）、氯己定、十二烷基硫酸钠（SDS）、十六烷基三甲基溴化铵（CTM）、季铵化合物（QACs）、Triton X-100、CTAB和脱氧胆酸钠（SDC）等消毒剂和表面活性剂的抗性相关基因，以及多种有机溶剂、酸、碱、酚类、脂肪酸和离子载体抗性相关基因。
抗生素抗性基因注释显示，最丰富的类别为肽类抗生素抗性基因（42个拷贝），其次为糖肽类（34个）、四环素类（32个）和氟喹诺酮类（31个）。青霉素类和大环内酯类抗性相关基因各26个拷贝，消毒剂和防腐剂抗性相关基因25个。氯霉素、氨基糖苷类和头孢菌素类抗性相关基因分别为24、21和21个拷贝。但需注意，许多注释可能对应保守持家基因或广谱外排泵，而非临床相关的抗生素耐药机制。
毒力因子数据库（VFDB）注释鉴定出多个功能类别的毒力相关基因，其中营养与代谢类基因数量最多（99个拷贝），其次为免疫调节（85个）、运动性（60个）和外毒素（50个）。此外还鉴定出29个黏附相关基因、28个调控系统基因、28个效应物转运系统基因、20个生物膜形成相关基因、12个胁迫耐受基因和4个胞外酶编码基因。值得注意的是，仅检测到1个侵袭相关毒力基因。
四、讨论总结
在讨论部分，研究人员首先指出，尽管dDDH的d4值（64.3%）低于70%的物种阈值，但ANI值（95.73%）超过95%的界定标准，且系统发育分析一致支持菌株hhy901归属于短小芽孢杆菌，这种ANI高于阈值而dDDH低于阈值的模式在泛基因组较大、水平基因转移率高的细菌物种中偶有出现。在粪臭素降解性能方面，菌株hhy901在96 h内对100 mg/L粪臭素的去除率达87.12%，降解速率为0.908 mg/L/h，显著高于此前报道的芽孢杆菌菌株（相同初始浓度下瘤胃芽孢杆菌分离株的降解速率仅为0.479 mg/L/h），这可能反映了该菌株对新鲜牛粪中高浓度粪臭素环境长期适应选择的结果。研究人员基于基因组注释提出了推定的粪臭素降解途径：粪臭素可能首先经细胞色素P450单加氧酶（cypD_E）或其他氧化还原酶催化吡咯环或苯环羟基化，单胺氧化酶（aofH）可能参与吲哚氮的氧化脱氨促进开环，随后由儿茶酚2,3-双加氧酶（catE）催化儿茶酚类中间体的间位裂解，裂解产物经DmpD、PcaC和PraC等酶加工，最终通过苯乙酸降解通路和β-氧化进入三羧酸（TCA）循环。在环境胁迫适应方面，基因组携带的重金属、消毒剂和氧化胁迫抗性相关基因与菌株分离自粪便环境的选择压力一致，但所有抗性预测均需表型验证。在生物安全方面，仅检测到1个侵袭相关基因，毒力因子注释主要对应保守细胞功能，提示侵袭性致病潜力相对较低，但多种抗菌药物耐药决定因子的存在仍需谨慎解读，必须通过表型抗菌药物敏感性试验、细胞毒性试验和必要的动物模型研究建立明确的安全档案。在实际应用层面，芽孢杆菌的内生孢子形成能力有利于制备货架期稳定的孢子型接种剂，广谱碳水化合物活性酶库（108个CAZy基因）可能支持其在粪便多糖上的快速增殖，但菌株在真实粪便系统中的定殖能力、与土著微生物的竞争、最佳施用剂量和条件等仍需通过中试规模试验确定。
五、研究结论
本研究从牛粪中分离出一株粪臭素降解细菌，通过多相分类学并结合基于基因组的ANI分析将其鉴定为短小芽孢杆菌hhy901。在实验室条件下，该菌株在96 h内去除了100 mg/L粪臭素的87.12%，降解速率高于此前报道的芽孢杆菌粪臭素降解菌株。全基因组测序揭示其基因组约为3.6 Mb，编码3564个蛋白质编码基因，包括39个与外源化合物生物降解相关的潜在基因、广泛的胁迫抗性决定因子以及相对较少的侵袭相关毒力因子。这些基因组特征表明，hhy901具有芳香族化合物降解和环境适应的遗传潜力，与其观察到的粪臭素去除表型一致。然而，需要强调的是，本研究呈现的功能注释、降解途径模型、胁迫抗性预测和生物安全评估主要基于基因组推断，需要实验验证。该菌株应被视为进一步开发的候选菌株，而非已确认的生物脱臭产品。未来研究应聚焦于降解途径的功能验证、胁迫抗性和生物安全的表型表征，以及评估实际效果的中试规模田间试验。通过这些验证，短小芽孢杆菌hhy901有望为集约化畜禽生产中的可持续生物臭味控制技术的发展做出贡献。
