本综述概述了猪营养研究中所需要且常用的一些主要方法，涵盖实验开始之前以及实验实施阶段。恰当的研究方法对于准确评估日粮干预措施对一系列结果指标（如猪的生产性能、养分利用效率，以及日益受到关注的环境足迹影响和猪肉生产评估）至关重要。猪营养实验通常涉及采用受控的饲喂试验，使用基于年龄、体重和/或生产阶段（断奶仔猪、生长猪、育肥猪和母猪）明确划分的动物群体。诸如随机完全区组设计或析因设计等实验设计常用于检验不同处理、最小化变异性并确保统计可靠性。原料评价与饲料配方是这些研究的核心，依赖于根据既定营养标准与测定方法对能量和/或养分含量进行精确计算。研究用原料通常根据其养分组成、消化率和可利用性进行选择，尽管适口性和抗营养因子等其他影响因素也可纳入考虑；试验日粮的配制旨在分离特定营养素或饲料添加剂等对一系列结果指标的影响。应根据所开展的研究类型对原料和饲料样品进行分析，例如，采用近红外光谱（NIRS）、弹式量热法或凯氏定氮分析等标准化实验室技术测定常规成分、氨基酸谱和能量含量。动物生产性能通常通过采食量、增重和饲料转化效率的测定来评估，而消化率试验通常包括粪便和/或回肠取样，以确定养分和/或能量的吸收效率及全身利用情况。可同时进行血液、组织、微生物组和/或“组学”分析，以评估例如不同营养干预措施对代谢、免疫和/或肠道健康的影响。饲养条件、环境控制和动物福利标准依据机构和伦理法规予以维持，以确保符合司法管辖区规定，并保证结果的可重复性和有效性。总体而言，猪营养研究及其所依托的众多方法是全球猪肉生产的基石，融合了严格的实验设计、精确的饲料配方和综合分析手段，以评估日粮对包括生长性能、养分效率和动物健康在内的一系列不同结果指标的影响，从而为改进饲喂策略和促进全球猪肉生产的可持续性提供关键数据。
1. 引言
猪营养研究的主要目标是以提高商业化生产效率为终点，因此在全球猪肉生产体系转型中发挥了根本性作用。现代猪是将饲料转化为人类可食用蛋白质的高效转化者（van Barneveld等，2023），这在很大程度上归功于营养科学、遗传学、健康、生物安全以及饲养与管理技术和干预措施方面取得的重大进展。在这些因素中，鉴于饲料成本通常可占可变成本的55%-65%，营养是决定生长性能、饲料效率、健康、繁殖能力和胴体品质的关键因素。同样重要的是，营养研究日益支撑着改善动物福利和健康的努力（Johnson等，2022；Pluske等，2018），以及减少养猪生产环境足迹的工作（Llorens等，2024；Maher等，2025；Pexas和Kyriazakis，2023；Stein等，2016）。
猪营养学的基本概念之一是养分利用研究（Baker，1986）。探究饲喂猪的养分利用实验是猪营养科学的基础，因为养分平衡的测定或对限制性养分的生物反应被用于确定需求量或表征新的饲料原料（Harmon，2020）。该领域的研究通常需要回答实际问题，例如新饲料原料是否能改善生长和饲料效率，以及/或减少氮和/或磷排泄，同时也要解决更基础的生物学问题，例如日粮氨基酸（AA）组成和供给如何影响激活的免疫系统或改变肠道健康。越来越多的猪营养实验正在评估非营养结果指标，如对免疫反应的影响、断奶后腹泻结果和/或排放影响（Pluske等，2018；Shurson等，2021；Shurson，2025）。无论最终目标如何，开发精确、可重复且可靠的猪营养实验方法至关重要。产生有效且可重复的结果需要严格的实验设计、对动物和环境因素的关注、精确的日粮配方以及可靠的响应测量。
关于这一主题已有相当数量的已发表文献，其中部分由本特刊的其他作者编写。如本综述名称所示，为简洁起见，本章仅涵盖核心方法，而不会过多重复已在别处发表的信息。读者将在本综述中看到对这些资源的指引。然而，重点将放在实验开始前的方法学方面，包括实验设计和假设生成的主要原则、重复和统计考量及其他注意事项。本章其他部分将涵盖动物管理、日粮配方、养分利用方法学、生长和营养评估，并最后给出一些综合性评论。
2. 猪营养研究中的实验设计
猪营养实验设计在过去一个世纪中发生了巨大变化。它已从主要基于观察、通常使用少量未改良基因型动物且缺乏可靠重复和/或对照的方法，发展到采用多种经典和现代设计的更大规模、更具统计可靠性和可重复性的研究，这些设计针对从原料评价和养分需求估计到健康、繁殖和精准饲喂研究等不同目标。然而，猪营养研究中当时和现在的一个关键挑战是控制生物变异性以最大化实验效能。猪在遗传背景、性别、体重（BW）、健康状况和行为上存在固有差异，所有这些因素都可能影响实验结果。此外，饲养条件、温度和饲养密度等环境因素又增加了变异层次。因此，实验设计必须设法在保持外部有效性的同时最小化生物和环境“噪声”，确保结果既具有科学严谨性又具有实际适用性（Whittemore，1998）。
2.1. 从起点开始：实验假设
为确保猪科学实验得出可靠、可解释且可重复并转化为实践的结论，科学研究必须基于严谨且表述得当的假设（或多项假设）。将研究假设表述为统计假设至关重要。正如Pulina（2025）所阐述的，假设既不是意图声明，也不是对可能结果的模糊建议，而是一个可检验、可证伪且具有逻辑基础的命题，它阐述了在特定条件下定义变量之间的预期关系。Beveridge（1950）称假设为“研究中的主要智力工具”，du Sert等（2020）指出，在报告动物研究时，应将所检验的具体假设（或多项假设）作为目标的一部分（见第7节的进一步讨论）。
从统计学角度看，假设由零假设（H0）和备择假设（HA）组成，前者假设不存在差异或效应，后者假设存在特定效应或关系。这将在第2.3节进一步讨论，但无论如何，在精心设计的研究中，假设必须指导实验计划并界定总体、背景和推断范围（Pulina，2025）。在这方面，Pulina（2025）制定了一个10步清单，帮助正确表述假设以先于并指导实验设计，要求每个假设都基于先前知识，并包含明确的推断范围和适合背景的可测量变量。
假设还构成科学方法的关键方面，可综合为四个阶段：1）观察和描述科学现象；2）表述假设和问题；3）基于所表述假设预测结果；4）采用适当方法实施程序以检验假设（Festing，2003；Johnson和Besselsen，2002）。
2.2. 实验单元与重复
Mead等（2012）将实验单元定义为实验材料中可独立接受处理的最小划分单位，或在析因实验中可一次随机化分配的处理组合单位（Aaron和Hay，2004）。在猪营养研究中，实验单元可能是1）单头猪（例如在代谢和消化率研究中，或动物单栏饲养的生长研究中），2）猪栏（在商业风格群体饲养生长试验中更常见），3）窝（常用于母猪和仔猪研究，例如断奶前营养干预），或4）母猪（用于评估例如妊娠期或哺乳期日粮效应的繁殖研究）（表1）。实验单元的正确定义很重要，因为接受相同处理的实验单元之间的变异为评估处理效应提供了无偏的误差估计（Aaron和Hay，2001，2004）。然而，正如下文进一步讨论的，特别是在大型研究或商业群体中，当动物以每组一个处理组的群体方式管理时，定义实验单元可能具有挑战性。
表1. 猪营养研究中常见的实验单元、其应用、优点和局限性。
| 实验单元 | 典型应用 | 优点 | 局限性 | 示例参考文献 |
|---------|---------|------|--------|------------|
| 单头猪 | 消化率和代谢研究 | 精确测量，减少社会效应 | 劳动强度高，可能不能反映商业条件 | Adeola, 2001 |
| 猪栏 | 生长性能试验 | 反映商业现实，物流更方便 | 采食量数据精度较低，存在竞争效应 | Patience等，2015 |
| 窝 | 断奶前仔猪研究 | 考虑母体效应 | 遗传/环境混杂 | Cloutier等，2024 |
| 母猪 | 妊娠/哺乳营养 | 直接测量繁殖反应 | 变异大，成本高 | Cloutier等，2024 |
与实验单元交织在一起的是重复，指将多个实验单元分配到同一处理，每次处理重复都是一个独立观察。实验单元的正确定义决定了要重复的实体。Aaron和Hay（2004）中的以下示例可以说明这一点：一项实验旨在比较四种不同日粮对生长-育肥猪性能的影响。有四个相同大小的猪栏可用，每栏饲养八头所需年龄、性别和体重的猪。研究人员随机将八头猪分配到每栏，然后随机将日粮分配到各栏。研究人员认为“猪”是实验单元，有八次重复。然而，由于日粮被分配给猪栏，且同一栏中的所有猪接受相同日粮，因此“猪栏”才是实验单元。结果，该实验没有重复（存在伪重复；见下文），需要进一步假设才能得出有效结论。
因此，重复的基本目的是提供实验误差的估计。通常，增加重复次数会得到更准确的实验误差估计和更精确的处理效应估计。对于特定实验所需的重复次数取决于在指定显著性水平下要检测的差异或效应的大小、功效以及实验材料的变异性（Aaron和Hay，2004）。这将在第2.3节样本量和功效分析、第2.4节随机化和区组中进一步讨论。
实验单元不要与观察单元混淆。观察（或取样）单元指对实验单元进行的测量，即实验中测量感兴趣结果的物理实体（Kuehl，2000；Casella，2008）。例如，如果新饲料给予个体动物，则动物是实验单元和观察单元。然而，如果一组动物饲养在同一栏接受相同日粮，则猪栏是实验单元，个体动物测量成为观察（或取样）单元（通常在统计分析中取平均值）。然而，Bello等（2016）在乳品科学中提供了示例，说明实验单元和观察单元之间的区分不一定简单，同一物理实体（动物或猪栏）可在同一实验中扮演实验单元或观察单元的角色（例如裂区设计）。Bello等（2016）指出，研究中实验单元的正确识别需要结合特定研究问题（即处理对特定感兴趣结果的影响）以及数据收集过程中的许多后勤细节（即实验设计和相应数据结构）来构建。
在这方面，如前所述，当处理或主要干预适用于整个群体（实验单元），但对每个观察单元进行测量/取样（例如个体动物测量）时，就会发生伪重复（Fenlon等，2024）。这意味着群体内的不同动物，即实验单元内的动物，是伪重复，而不是实验重复。在这些条件下，观察单元层面的测量可能看似独立，但可能受到动物间行为（如个体动物的采食量）的影响。Fenlon等（2024）详细解释了这些考虑，应在任何猪营养实验设计中予以考虑，尤其是在单栋或单间中群体饲养动物的情况下。
2.3. 样本量与功效分析
设计实验时首先要考虑的是进行功效检验，以确定需要多少观察（重复）才能在处理之间检测到统计学显著差异。进行功效检验的基本信息包括：1）显著性水平，2）要检测的差异或效应大小，3）检测效应的功效，4）反应的变异性，以及5）重复次数或样本量。这五项信息并非独立；其中任意四项自动确定第五项（Aaron和Hay，2004）。实际上，实验规模（即重复次数）由感兴趣反应变量的变异系数（CV）、实验者选择的α水平以及期望的实验功效决定。当反应变量的CV增加且α水平和期望功效保持不变时，检测处理间统计学显著差异所需的重复次数相应增加（Johnston等，2003）。
功效分析的必要性基本上围绕研究人员对确立备择（或研究）假设有效性的兴趣（Pesti等，2016）。在经典假设检验中，决定是接受还是拒绝零假设（H0）。拒绝零假设指向备择假设（HA）的有效性。H0假设处理未引起反应变量的差异，而HA声明所施加的处理确实引起了反应变量的差异。一旦确立了适当的假设，研究人员选择用于评估结果的α水平。α水平是当处理间实际无差异时，错误拒绝H0（即认为处理不同）的概率度量。从这个意义上讲，错误拒绝H0称为I型错误。α水平为0.05（P<0.05）表示发生I型错误的概率小于5%或二十分之一，或者反过来，H0将被正确接受的概率为95%。接受H0意味着处理间差异证据不足，接受H0不能让人自信地说处理间无差异。α水平为0.10（P<0.10）意味着研究者在十个实验中有一个会错误地认为处理确实影响了反应变量，但其余90%是正确的（Johnston等，2003；Patience，2016）。
因此，实验功效由研究者错误接受H0（即未检测到真实处理差异）的概率决定。这是II型错误。可接受的II型错误率记为β，通常设为0.20，这意味着真实处理差异有20%的时间检测不到。然而，研究者有80%的时间能准确检测到差异（即接受HA）。准确检测差异的能力被视为实验的功效（1-β）（Johnston等，2003）。尽管如此，正如Aaron和Hays（2004）敏锐指出的，α和β的值是任意的。它们应基于I型和II型错误的相对后果；通常，它们只是惯例值。此外，最小可检测差异也可能是任意的，但理想情况下，它应是在生物学或经济上有意义的最小差异，实际中可能难以定义。虽然这些告诫似乎意味着功效分析产生的重复次数不过是一个猜测，但底线是它是最好的猜测。
对相关变量的CV进行估计是进行功效检验的基本要求。这通常从其他研究者在与拟议研究相似条件下进行的已发表研究获得，最有价值的CV是在与拟议实验相同条件下（即相似的遗传、饲养、健康状况、营养等）收集的数据计算得到的CV（Aaron和Hay，2004；Johnston等，2003；Patience，2016）。了解CV加上知道要检测的差异大小（I型和II型错误率）后，可以参考已发表的表格来确定检测处理差异所需的重复次数（例如表2）。还有许多在线功效分析计算器。
表2. 每组实现统计学显著结果所需的重复次数（假设80%功效，P<0.05）（改编自Berndston，1991）。
CV, % | 与对照组差异需检测的百分比，5% | 10% | 15% | 20%
------|------|------|------|------
1 | 32 | ND | ND | ND
2 | 43 | 24 | ND | ND
3 | 73 | 32 | 41 | 24
4 | 335 | 176 | 436 | 247
5 | 437 | 329 | 548 | 421
6 | 495 | 214 | 751 | 063
7 | 961 | 291 | 241 | 243
8 | 215 | 916 | 161 | 421
9 | 122 | 182 | 045 | 224
10 | 141 | 425 | 203 | 329
15 | 253 | 939 | 945 | 263
20 | 566 | 142 | 633 | 577
30 | 193 | 865 | 040 | 100
40 | 525 | 211 | 126 | 345
50 | 127 | 231 | 814 | 280
60 | 501 | 571 | 393 | 175
70 | 199 | 386 | 501 | 401
75 | 199 | 386 | 501 | 401
CV = 变异系数；ND = 未进行。
CV (%) = (标准差/处理平均值) × 100。
然而，研究中所需的样本量可能因感兴趣变量而异。猪营养研究通常涉及生长速率和采食量等反应，但养猪生产系统中其他变量也可能对经济可行性和可持续性产生重大影响。例如，死亡率历史上是相对于生长和饲料效率的次要结果，因为大多数研究没有足够的功效来检测任何观察到的差异。此外，对于不符合高斯（正态）分布的观察反应（如死亡率），功效计算比标准功效计算更复杂，考虑数据结构（包括区组和子采样）进一步增加了挑战（Gebhardt等，2020）。在一项旨在说明使用易于实施的统计模型来确定样本量以检测不同死亡率水平组间统计学显著差异的研究中，Gebhardt等（2020）创建了场景，其中独立应用处理的实验单元是1200头猪舍的一半（群体层面）或单个猪栏（猪栏层面，每栏25头猪，共48栏），在1200头猪舍内。模型输入包括猪数量、猪舍和猪栏（如适用），模型输出是计算的统计功效。
这些作者报告说，当实验单元是半栋猪舍且死亡率在群体层面测量时，需要七栋猪舍才能检测到1%的死亡率差异（两组分别为2%对1%）。随着两组间观察到的死亡率差异增加，检测相应差异所需的猪舍数量减少，反之亦然。然而，当实验单元为包含25头猪的单个猪栏，且死亡率在猪栏层面测量时，共需240个猪栏或五栋猪舍才能检测到同样的从2%降至1%的1%死亡率下降。比较群体或猪栏层面死亡率得出的结果，检测差异所需的猪数量相对接近，例如，如果比较3%对4%的群体死亡率，群体层面死亡率所需的猪舍数为11，而猪栏层面死亡率为9。
猪营养研究的主要目的很少是死亡率，但鉴于生长-育肥猪死亡率可能超过5%-8%，从而减少全价值猪的数量，评估死亡率本身可能值得关注（Petry和Patience，2020）。在这种情况下，Gebhardt等（2020）的观察具有相关性。
2.4. 随机化与区组
确定重复次数后，使用随机化来确保所有实验单元有同等机会被分配到任何可用处理（Aaron和Hays，2001）。理论上，实验动物代表感兴趣的动物总体，因此需要从总体中随机选择。这通常不可行，甚至不可能。然而，将处理随机分配到实验单元是证明和确立对总体参数和假设检验进行统计推断有效性的最重要和最关键的步骤（Seo等，2018）。
此外，为了恰当检验处理效应，应最小化或至少考虑主要处理之外可能影响动物反应的因素。在这方面，建议使用区组或协变量。区组是一种做法，其中实验单元根据一个或多个已知或预期会影响实验中要测量和检验的生物反应的因素分成相似单元组，即“能区组的就区组，不能区组的就随机化”（Fenlon等，2024）。物理和生理特征，如性别、窝和初始体重（BW），常用于动物科学领域的区组，但也可以扩展到例如处理在房间中的物理位置。区组控制实验单元的变异性并减少实验误差。
区组的重要性在Kpodo等（2019）的一项研究中得到证明，该研究检查了夏末6周内猪栏位置对猪体温调节和生长性能的影响。猪栏位置根据相对于通风风扇和进风口的方位确定。内部栏（IP；每栋4栏）位于风扇和进风口之间的直接视线内，而周边栏（PP；每栋4栏）位于风扇任一侧0.70±0.29 m处。研究人员发现，尽管所有猪栏的环境温度和相对湿度相似，但猪栏的物理位置对体温有显著影响，进而负面影响了饲料增重比（表3）。
表3. 夏末生长-育肥猪猪栏位置（L）和记录期（P）对生长参数的影响（改编自Kpodo等，2019）。
| 项目 | P1 PP | P1 IP | P2 PP | P2 IP | P3 PP | P3 IP | SEM | P值 (L) | P值 (P) | P值 (L×P) |
|------|-------|-------|-------|-------|-------|-------|-----|---------|---------|-----------|
| 日采食量, kg | 2.12 | 2.11 | 2.21 | 2.17 | 2.50 | 2.45 | 0.08 | 0.71 | <0.01 | 0.78 |
| 日增重, kg | 0.68 | 0.69 | 0.68 | 0.74 | 0.80 | 0.81 | 0.03 | 0.28 | <0.01 | 0.78 |
| 料重比, kg:kg | 0.32 | 0.33 | 0.32 | 0.35 | 0.32 | 0.33 | 0.01 | 0.02 | 0.40 | 0.18 |
PP = 周边栏；IP = 内部栏；SEM = 平均标准误。
1 PP，位于最近风扇任一侧0.70 ± 0.29 m。
2 IP，位于风扇和进风口之间的直接视线内。
3. 猪营养研究中的统计与伦理考虑
猪营养实验通常采用几种经典统计设计，各有优缺点。这些在Pesti等（2016）等文献中有描述，此处不再详述。简单实验设计，如完全随机设计（CRD）、随机完全区组设计（RCBD）（有无析因处理结构均可）以及拉丁方和交叉设计，在猪营养实验中特别有用，因为它们是平衡的，所有处理因子水平和组织（如区组）的级别都均匀出现（Fenlon等，2024）。这些统计设计可总结如下：
1）CRD：最简单的实验设计类型，动物独立于所有因素随机分配到处理，即无限制。当实验单元相对同质且变异性低时适用，但该设计对异质性敏感，因此可能需要较大样本量以达到足够的统计功效。
2）RCBD：根据已知变异来源（如初始BW、性别或窝）将动物分组为区组，并在区组内随机分配处理。这种设计控制已知变异，提高精度，但依赖于正确选择区组因素，如果变异未知或区组异质，则可能不适合。
关于这两种随机化方法，Jenkins等（2024）评估了在受控试验中断奶时将猪分配到猪栏的不同策略。猪被分成三个队列，平均体重和标准差相似，并随机分配到三种分配策略之一：1）策略1，采用CRD将猪分配到猪栏；2）策略2（体重分布），将队列内每头猪按五个体重组之一排序。然后从每个体重组随机选择一头猪分配到一栏，使栏内体重分布在各栏间均匀；3）策略3（体重分组），将队列内猪按三个体重类别（轻、中、重）排序。在每个体重类别内，猪被随机分配到猪栏，形成来自每个体重类别的猪栏。猪随后进行两项营养研究，目的是确定对CV的影响，从而根据分配策略估计找到显著处理差异所需的重复次数。
根据数据，Jenkins等（2024）得出结论，在以猪栏作为实验单元的保育研究中，使用体重分组策略将猪分配到猪栏将导致最小的栏内和栏间变异。这与更常用的完全随机化方法相反，后者通常需要最多的重复次数才能找到显著差异。
3）拉丁方设计：该设计涉及每个处理在方形矩阵的每一行和每一列中各出现一次，控制两个区组因素（如时期和猪），常见于交叉消化率或代谢研究。使用拉丁方设计以较少的动物控制多个变异来源，但要求严格假设（无残留效应），并且根据资源可能只包含有限数量的处理。
在这方面，Goedhart（1990）报告称，有强有力的证据表明，在40-100 kg猪的拉丁方设计中，至少一个应用拉丁方设计所需的条件（即无时期×猪互作）未得到满足。作者得出结论，拉丁方设计不适合在该体重范围内生长的猪进行比较消化率试验，并且由于猪的消化能力随体重增加而增强，在固定体重下比较日粮消化率是可取的，这将减少实验误差。Goedhart（1990）总结道，如果对研究日粮的统计比较不感兴趣，拉丁方仍然有用，因为它给出了40至100 kg体重范围内的平均消化率值。
4）析因设计：这些设计同时评估两个或多个因素（如蛋白质×能量水平、日粮×酶补充、饲养×营养效应），对于研究实验因素之间的交互作用（如果怀疑存在）是高效的。然而，实验复杂性和统计解释可能随着附加因素迅速增加。
5）交叉设计：每只动物按顺序接受多个处理，期间有清洗期。这种方法在动物数量有限的消化率/代谢研究中很有用，但如果清洗期未执行或间隔不足，则存在残留效应风险。
3.1. 自变量（处理）的选择
猪营养实验可能涉及改变或操纵某种处理因素，例如添加饲料添加剂。因此，处理可能包括一个或多个“对照”，以加强结论并正确解释实验数据。一般来说，每个实验应使用与实验组动物直接对比的对照组动物（Johnson和Besselsen，2002；O’Neill，2016）。阳性对照（处理）用于确认实验处理测量方法按预期工作，即验证例如某种营养素或添加剂的（阳性）实验结果。相反，阴性对照（处理）显示没有特定干预（例如特定营养素或添加剂）的基线效应，预期无显著有益变化或反应。此类对照验证实验设置，使研究人员能够将观察到的效应归因于测试变量，而不是设备故障、实验错误或其他不受控制的影响。
Stensland等（2015）的实验说明了这种方法。该研究旨在检验添加氧化锌（ZnO）或有机酸、肉桂醛和透化复合物（OACP）混合物的日粮对感染产肠毒素大肠杆菌的猪断奶后腹泻（PWD）和性能的影响。研究提出OACP产品可能替代ZnO用于断奶后无抗菌药物营养方案。共有72头22日龄断奶、体重7.2±1.02 kg的猪按RCBD分配到三种处理之一：1）阴性对照：基础日粮（无抗菌化合物）；2）阳性对照：基础日粮+3 g ZnO/kg；3）“测试”日粮：基础日粮+1.5 g OACP/kg。在此例中，ZnO因其缓解PWD的公认机制被用作阳性对照，并且由于研究目标之一是在无抗菌药物饲喂环境下进行比较，阴性对照（处理）不含任何抗菌产品。
一个没有适当对照处理（或组）（本例中为阴性对照）的例子可从以下研究看出。该实验（Lemoine等，2024）评估了提高熟化谷物：总谷物比例（C:T）对断奶后仔猪性能和健康的影响。共240头仔猪在预开食期（断奶后至第20天）分配到四种日粮处理，C:T比例分别为10%、20%、30%或40%。然而，由于未包含0% C:T（作为阴性对照），无法明确得出最能支持断奶后仔猪性能和健康的C:T比例。
考虑到这一切，有必要从发表角度描述期刊编辑在报告和描述实验设计和统计方法时的建议。例如，在《亚洲-大洋洲动物科学杂志》编辑委员会的综述中（Seo等，2018），提出以下建议：
1）在材料与方法部分提供实验设计和统计方法的细节。
2）定义实验单元并报告重复次数。重复必须是独立观察，实验单元必须彼此独立。
3）进行功效检验并提供结果，以证明实验设计适当。
4）尽可能使用区组或协变量以减少无法解释的实验误差。
5）描述用于最小化可能残留效应的程序，并在使用交叉设计时证明残留效应不显著。
6）确保在取样实验单元和将处理分配给实验单元时实施随机化。
7）将用于统计分析的统计模型以方程和文字形式描述。
8）根据观察数据类型、要回答的研究问题和统计模型使用适当的统计方法。
9）检验观察值是否围绕平均值正态分布。如果不是或样本量不够大，则使用非参数分析；否则使用参数方法。
10）在统计分析部分说明统计显著性水平。
11）在处理间存在显著差异的基础上进行事后分析，并根据处理结构使用适当方法。
12）仅在一系列处理之间无结构时进行两两比较（如Duncan多重极差检验）。
13）报告用于统计分析的软件和程序。
14）如果观察值为重复测量或预期存在随机效应，使用适当的统计方法和程序。
15）同时提供概率值（P值）和合并标准误（SEM）作为误差度量。标准差只能用于描述性统计。
16）在材料与方法部分或更合适的结果部分报告离群值或缺失数据。
Fenlon等（2024）在其出色的“作者统计指南”中也提出了类似建议。
3.2. 伦理考虑
在猪营养研究（或一系列研究）开始之前，通常需要（通常为法律要求）通过例如动物伦理委员会、动物护理委员会或研究所在国的相应机构获得批准/许可。此类申请需要概述研究背景、目的、目标或假设、实验设计和方法、统计事项（包括所需动物数量的理由）、饲养和住宿细节、程序（包括常规动物监测和管理以及任何非手术和手术干预）、项目结束时动物的命运（包括死亡终点）等。
伦理委员会使用的指导规范通常涉及3R原则——替代、减少和优化（Russell和Burch，1959）——这可能对猪营养实验有影响：
1）替代。这涉及是否有可能用其他方式替代或避免使用猪来达到相同实验目标，例如体外技术、基于先前记录数据的统计建模。对于大多数猪营养研究，这并不总是可能或可行的，尽管人工神经网络等机器学习方法的出现为在某些类型实验中替代猪的使用提供了新的方法。例如，Bhoj等（2023）表明，猪的胴体重传统上通过活体实验评估，可以使用有限数量的形态测量参数（心围和瘤胃围）以>99%的准确率预测。
2）减少。这与本综述已讨论的因素（第2.2节实验单元与重复、第2.3节样本量与功效分析）有关，要求研究人员通过统计计算（使用功效分析）确定最小动物数量，以确保仍能获得统计学上有意义的结果。一些期刊现在要求样本量估计和功效分析的理由和细节，或作为标准包含，或在存在特定关注时。
3）优化。这涉及改善每只实验动物可能经历的福利并减少疼痛、痛苦和不适。通过适合年龄的饲养、处理和人道终点来最小化疼痛、不适和痛苦是这一原则的关键特征。关于营养和饲喂，应尽可能避免将营养限制在维持需要以下和/或故意限制生长动物的采食器，因为资源（食物、水）剥夺可能导致动物痛苦和/或意外行为改变。
然而，在极少数情况下，猪营养研究可能不得不检查优化并不简单甚至不可能的场景。例如，在美国和其他国家，COVID-19大流行导致许多生猪加工厂同时关闭或（严重）减少运营，造成重大供应链中断。鉴于加工能力与所生产的猪数量密切相关，屠宰厂停工或减速可能迅速导致农场待宰猪积压。为此，大流行期间采用了多种策略来降低农场生长速率，避免猪生长超过加工设施无法接受的程度（Tokach等，2021）。
考虑到这一点，在爱荷华州立大学机构动物护理和使用委员会（IACUC方案#21-042）批准所有程序并遵守研究动物伦理和人道使用的前提下，Miller等（2022）在模拟饲料供应短缺的情况下，评估了群体饲养育肥猪的饲喂策略，包括仅略高于维持需要饲喂以及调整饲喂器以故意限制采食量。评估了其性能和行为（如攻击行为）。如预期，以1.45倍或2倍维持需要饲喂群体猪14天导致日增重急剧下降，分别比自由采食对照组下降98%和69%。此外，在14天干预期间，维持饲喂和限制饲喂使行为攻击指数比对照组（自由采食）猪增加10%至30%。
4. 猪营养研究的其他方法学考虑
在制定实验方案（或采用他人方案）之前，有必要考虑与研究准备、实施和分析相关的各种其他一般原则和/或实践。Bedford（2016）和Patience（2016）详细介绍了这些内容，读者可参阅这些文献获取详细信息，但主要考虑因素是拟用设施（或设施）的能力。这包括设施容量（例如，是否有足够的猪栏满足所需重复和处理？）、地板和猪栏（例如，是否符合标准，猪栏是否适合用途，饲喂器和饮水器是否合适？）、照明和光周期考虑（例如，光周期调控可能影响发情表达和泌乳性能）、通风设计和能力（包括适合所使用猪阶段/类别的热环境以及去除NH
3等有害气体）、适合用途（对猪和人）的处理和测量设施（如称重秤），以及标准化样品和数据收集实践。其他考虑包括充分和严格的健康和生物安全要求和规程，因为健康挑战可能通过改变采食量、代谢和免疫功能来混淆营养研究。高健康猪群提供较低变异和更清晰的营养反应，但在商业样健康挑战下（如使用产肠毒素大肠杆菌攻毒）的实验可能更好地反映商业条件（Pluske等，2018）。
猪营养研究中的一个关键考虑显然是饲料的配制、制造和输送。Choct（2016a）指出，营养研究的实际相关性应从配制的对照日粮开始，这反过来需要三个最低限度的细节：1）可用于制造的原料的化学组成和营养价值；2）实验猪的营养需求；3）原料的加工需求。Choct（2016a）、O’Neill（2016）和Patience（2016）更详细地描述了这些方面，此处不再重复。然而，适用于某些猪营养研究（如某些日粮的商业评估，其中饲料边际成本优先）的是遵守一系列饲料配方原则。Black（2000）概述了最低成本日粮配方涉及的七个主要步骤，读者可参考该出版物获取更多信息。
取决于研究的性质，必须适当使用和报告（适用的）实验室和分析技术（例如，原料和/或日粮组分的常规分析、氨基酸谱、元素分析、脂肪酸分析、能量含量测定）（Patience，2016）。考虑到这一点，进行稳健、可重复和相关的猪营养研究的一个基本组成部分是确保最终配制的日粮（一种或多种）真正反映测试日粮成分的浓度/水平，即“计算”值类似于“分析”值。根据作者审阅大量论文的经验，这是许多稿件中的一个关键且重大缺陷。例如，在赖氨酸滴定研究中，在（外源）酶研究中，在探究不同饱和：不饱和脂肪酸比例的研究中，在探究不同水平日粮元素的研究中，这些自变量（“测试”变量）必须通过分析验证，以确保配制的（或“计算的”）浓度/水平与猪消耗的相同（或非常相似），因此所施加的实验处理在科学上是有效的，以支持任何结论。例如，计算值与分析值之间15%-20%的差异可能对研究结果及其相关性产生重大怀疑。
4.1. 粪便、尿液、血液和唾液取样
许多猪营养研究同时采集粪便和/或尿液和/或血液（以及较小程度的唾液），以支持实验（一项或多项）的任何额外影响（生化、生理和免疫等）的评估。Noblet等（2022）描述了与消化率评估相关的粪便和尿液收集方法，同样，Hodgkinson和Moughan（2000）、Lee和Stein（2023）以及Mosenthin等（2007）等作者描述了从T型瘘管（和其他瘘管）收集回肠食糜的方法。
同样，与营养研究相关的猪血液取样有许多技术和方法。血液样本是监测所有农场动物（包括猪）的营养、行为、健康相关和/或繁殖性状的重要基础。常规诊断和研究相关分析都依赖于血液样本的采集来分析各种化合物（如代谢物、离子、激素）的浓度，以更深入地了解生理和作用机制。血液样本通常通过静脉穿刺或导管插入获得，静脉穿刺通常在猪的颈静脉、耳静脉或隐静脉进行，而当需要重复采样时，将导管插入颈静脉或耳静脉被认为是金标准（Xavier等，2025）。
然而，正如Xavier等（2025）所强调的，两种方法都有技术限制，需要熟练且有经验的工作人员，因为猪的浅表和可见血管很少，动物通常紧张，且猪体力强。因此，所有这些方法都涉及不同程度的隔离、限制、侵入性或麻醉，血液取样从动物福利角度看可能有问题，因为它可能导致猪和人的疼痛和压力。Xavier等（2025）评估的不同重复采样技术强调了导管插入作为金标准的可靠性，尽管使用刺血针似乎有望减少猪的压力。
采集其他生物样本（例如唾液）作为与猪营养研究相关的血液取样的非侵入性替代方案，同样可以测量各种分析物以评估疾病、应激反应、炎症、免疫反应和营养需求。可以使用咬棉绳或海绵等方法收集样本，然后离心储存用于分析（White等，2014），但根据测量内容与血液中相同分析
