《Animal Feed Science and Technology》：GABA and feeding: A pathway to alleviate LPS-induced anorexia in northern snakehead (Channa argus)
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•饲料中预先补充γ-氨基丁酸（GABA）可通过平衡中枢-外周食欲相关基因表达和激素稳态，减轻北部蛇头鱼LPS诱导的神经-肠道炎症和采食抑制。•体内与体外联合试验揭示了GABA通过肠-脑轴发挥保护功能的潜在多组织协同信号。•二次回归分析估算出，在本实验条件下，改善生长性能的适宜
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饲料中预先补充γ-氨基丁酸（GABA）可通过平衡中枢-外周食欲相关基因表达和激素稳态，减轻北部蛇头鱼LPS诱导的神经-肠道炎症和采食抑制。
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体内与体外联合试验揭示了GABA通过肠-脑轴发挥保护功能的潜在多组织协同信号。
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二次回归分析估算出，在本实验条件下，改善生长性能的适宜饲料GABA补充水平为110.01–120 mg/kg。
引言
水产养殖的经济产出在很大程度上取决于鱼类的生长性能，而生长性能与自愿采食量密切相关。由于食欲是采食量的核心决定因素，探索鱼类食欲调控机制为开发新型促食剂奠定了基础（Wang et al., 2021）。脂多糖（LPS）是革兰氏阴性菌外膜的主要结构成分，在宿主入侵时易刺激全身性炎性细胞因子分泌（Aslizah et al., 2019）。我们实验室的先前工作证实，LPS能成功诱导北部蛇头鱼的采食抑制（Peng 2022），使LPS成为筛选抗食欲减退饲料添加剂和解剖其功能通路的可靠应激源。LPS诱导的厌食严重损害鱼类的采食和生长（Ray and Ghosh, 2024）。作为调节动物食欲和应激耐受性的关键神经递质。
GABA被认为是一种潜在的添加剂，可缓解LPS引起的采食抑制（Farris et al., 2022, Wu et al., 2016）。哺乳动物研究已确立，下丘脑神经元通过双向脑-肠信号整合外周营养和代谢线索来协调食欲。内源性合成的γ-氨基丁酸（GABA）是主要的中枢抑制性神经递质，在该食欲调控网络中占据核心地位（Wu et al., 2009, Hentges et al., 2004, Horvath et al., 1997）。在硬骨鱼中，GABA作为核心神经递质参与下丘脑食欲调控和肠-脑交互作用（He et al., 2017, Ray and Ghosh, 2024）。现有的硬骨鱼研究表明，饲料GABA可在多个鱼类物种中调节生长、摄食量和抗炎能力（Wu et al., 2016, Wu et al., 2016, Farris et al., 2022）。虽然哺乳动物模型已经很好地阐明了LPS如何通过神经炎症级联引发厌食以及GABA如何拮抗此类疾病相关的采食抑制，但硬骨鱼中相应的机制细节仍未完全阐明。与哺乳动物不同，硬骨鱼在下丘脑食欲神经元组成、肠-脑信号传递和GABA能突触反应方面表现出物种特异性特征。大多数水产养殖相关的研究分别考察了非应激条件下饲料GABA的功能或LPS引起的肠道炎症损伤。很少有研究将原代神经元体外干预、体内LPS应激模型和非靶向代谢组学相结合，系统解析GABA通过肠-脑轴挽救LPS诱导的摄食减少的机制（Yue et al., 2014）。已有文献报道，外源性饲料GABA补充可提高陆地牲畜、家禽以及水生甲壳类和硬骨鱼的食欲并缓解多种应激损伤（Cheng et al., 2016, Chettri et al., 2007, Dai et al., 2011, Wu et al., 2016）。先前在建鲤中的试验表明，饲料GABA可提高摄食量、生长速率、固有免疫以及对氨氮毒性的耐受性（Chen et al., 2020）。我们之前对北部蛇头鱼的饲喂试验进一步验证，补充GABA可加速躯体生长、提高肠道消化酶活性并改善抗氧化能力（Peng 2022）。总体而言，这些观察结果提示GABA在北部蛇头鱼中具有食欲调节能力和潜在的抗LPS诱导厌食保护作用；然而，其详细的分子调控级联尚未阐明。据我们所知，尚无已发表的研究评估饲料GABA是否缓解硬骨鱼的LPS诱导采食抑制，凸显了一个亟需系统研究的研究空白。
尽管先前研究表明饲料GABA可改善鱼类生长和应激耐受性，但GABA缓解LPS触发的厌食的分子级联在北部蛇头鱼中仍缺乏详细表征。为填补这一研究空白，本研究将体外原代下丘脑神经细胞试验与为期8周的体内饲喂试验相结合，随后进行肛门内LPS应激挑战。我们表征了神经元转录组和非靶向代谢组反应，以及中枢-外周组织生理和基因表达谱。本研究旨在阐明GABA抗LPS诱导厌食的肠-脑轴机制，并为GABA作为环保型水产饲料添加剂提供剂量参考。
章节片段
细胞提取、培养与鉴定
选取来自山东临沂某养殖场同一批次的健康北部蛇头鱼，体长均匀、体表完整，3月龄，初始体重（5.19 ± 0.12）g/尾。实验鱼用10 mg/L MS-222完全麻醉后，在无菌条件下进行下丘脑解剖。随后将鱼体浸泡于75%酒精中消毒3–5分钟。在无菌工作台中，用无菌剪刀剪开脑室，取出下丘脑
建立包含神经干细胞、星形胶质细胞样细胞和成熟神经元的可传代混合原代下丘脑细胞培养体系
倒置显微镜观察显示，消化后（图1.a），北部蛇头鱼原代下丘脑细胞贴壁缓慢，初始贴壁密度低，细胞呈不规则多边形。培养14天后（图1.b），细胞密度逐渐增加，细胞间形成突触连接网络。培养21天后（图1.c），细胞突起相互融合，胞质边界逐渐模糊，在
北部蛇头鱼混合原代下丘脑细胞培养的分离与鉴定
下丘脑整合外周营养和激素信号以调节鱼类食欲，原代下丘脑神经元培养为阐明摄食调控机制提供了直观的体外模型（Soengas et al., 2024; Sharpe, 2023）。先前的研究已在翘嘴鳜（Siniperca chuatsi）中建立了脑/下丘脑原代细胞体系（Shi et al., 2020, Kuang et al., 2021）。参照他们的酶消化和差异贴壁方法，本研究成功分离并
结论
在本研究中，我们利用体外原代下丘脑神经元、代谢组学和RT-qPCR表征了GABA和LPS对下丘脑神经元功能的独立和协同效应。体内试验证实，饲料GABA预先补充通过恢复下丘脑GAD和DAO活性、平衡肠道食欲调节激素、抑制肠道和中枢炎症反应，减轻了北部蛇头鱼的LPS诱导采食抑制。
结合而言
CRediT作者贡献声明
林云杰：撰写-审阅与编辑，撰写-原稿，监督，方法论，资金获取，形式分析。王营河：方法论，形式分析，数据管理。杨智南：可视化，验证，监督，软件。刘宏建：软件，方法论，资金获取，数据管理，概念化。金小燕：项目管理，方法论，资金获取，形式分析。安思宇：可视化，验证，监督，
伦理声明
本研究按照ARRIVE（动物研究：体内实验报告）指南进行。本研究经吉林农业大学批准。
利益冲突声明
所有作者声明：(i) 未从可能对提交工作感兴趣的任何组织获得支持，无论是财务方面还是其他方面；(ii) 不存在其他可能影响提交工作的关系或活动；(iii) 他们没有利益冲突。
致谢
本研究得到国家自然科学基金（32002406）、中国农业科研体系专项资金（CARS-46）、吉林省市场监督管理局科技计划项目（2023MK010）的支持。
林云杰 | 王营河 | 杨智南 | 刘宏建 | 金小燕 | 安思宇 | 陈秀美 | 王贵勤
