《Animals》：Establishment and Characterization of a Brain-Derived Cell Line from Japanese Eel (Anguilla Japonica) and Transcriptomic Analysis of Its Responses to Sex Steroid Hormones
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专业术语翻译摘要
日本鳗鲡（Anguilla japonica）是一种具有重要经济价值的水产养殖物种，但其性类固醇激素应答的细胞机制仍缺乏深入研究。在本研究中，研究人员建立并鉴定了一个来自日本鳗鲡脑组织的连续细胞系，命名为AJBC。该细胞系表现出稳定的成纤维细
专业术语翻译摘要
日本鳗鲡（Anguilla japonica）是一种具有重要经济价值的水产养殖物种，但其性类固醇激素应答的细胞机制仍缺乏深入研究。在本研究中，研究人员建立并鉴定了一个来自日本鳗鲡脑组织的连续细胞系，命名为AJBC。该细胞系表现出稳定的成纤维细胞样（fibroblast-like）形态和持续增殖能力。分子鉴定显示，与成纤维细胞样基质细胞群相关的标记基因col1a1呈高表达，而神经元和胶质细胞标记基因map2、gfap和sox2呈低表达。神经相关标记基因nestin可被检测到，表明AJBC细胞保留了部分脑组织相关特征。AJBC细胞成功转染了绿色荧光蛋白（GFP）表达质粒，证明其具备遗传操作的潜力。转录组分析发现，经17β-雌二醇（E2）和11-酮基睾酮（11-KT）处理后，分别鉴定出3212个和3522个差异表达基因（DEGs）。KEGG富集分析揭示了磷脂酰肌醇3-激酶-蛋白激酶B（PI3K-Akt）和丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路以及细胞黏附和细胞骨架相关过程的显著富集。代表性的繁殖相关基因，包括sox9和foxl2，在性类固醇激素处理后表现出差异表达。E2处理上调了雌激素受体基因esr1和esr2的表达，而11-KT处理则上调了雄激素受体基因ar的表达，证实了AJBC细胞具有类固醇应答特性。该脑源细胞系为研究日本鳗鲡的性类固醇应答分子机制和神经内分泌相关过程提供了有用的体外模型。
论文解读
一、研究背景与意义
日本鳗鲡（Anguilla japonica）是东亚地区重要的经济水产养殖物种，尤其在中国、日本和韩国被广泛养殖。然而，近年来日本鳗鲡种群数量显著下降，栖息地丧失、过度捕捞、洄游障碍以及环境和海洋变化被认为是重要影响因素。2014年，该物种被列入世界自然保护联盟（IUCN）红色名录，列为濒危（EN）物种。尽管在人工催熟、诱导产卵和仔鱼培育方面取得了显著进展，但商业上可行的封闭循环生产仍面临挑战。其中一个主要瓶颈在于对调控生殖成熟和发育的内分泌及分子机制认识不足，这限制了人工繁殖技术的进一步优化。
在硬骨鱼类中，生殖发育主要受下丘脑-垂体-性腺（HPG）轴调控，脑作为中枢调控器官，整合环境、营养和内分泌信号，协调生殖内分泌活动。脑内的神经回路整合促性腺激素释放激素（GnRH）、kisspeptin、多巴胺等神经内分泌信号，调节垂体促性腺激素的释放和性腺类固醇生成。此外，脑也是循环类固醇激素的重要靶器官，雌激素和雄激素通过基因组和非基因组信号通路作用于神经细胞，调节神经元功能、突触可塑性、神经发生和生殖行为。然而，以往研究多依赖整体组织分析或体内激素给药，难以区分细胞的直接应答与继发的系统性内分泌效应。因此，缺乏脑源体外模型是研究日本鳗鲡脑细胞对性类固醇激素直接分子应答的重要限制。本研究旨在建立日本鳗鲡脑源稳定细胞系，为研究性类固醇激素应答的分子机制提供体外平台。
二、研究内容与主要结论
研究人员采用组织块贴壁法建立了日本鳗鲡脑源连续细胞系AJBC，并系统鉴定了其生物学特性，包括细胞形态、生长特征、染色体稳定性、物种鉴定和转染效率。在此基础上，利用RNA测序（RNA-seq）技术分析了AJBC细胞对E2和11-KT处理的转录组应答，通过差异表达分析和功能富集分析鉴定了与神经内分泌和生殖过程相关的激素应答基因和信号通路。该研究建立了日本鳗鲡脑源体外细胞平台，为研究该物种的类固醇激素应答和神经内分泌信号提供了有用模型。
三、主要关键技术方法
研究人员从福建福清商业养殖场获取一尾约450 g的雌性日本鳗鲡（卵巢发育中期），无菌采集脑组织用于原代培养。采用组织块贴壁法建立原代培养，经连续传代获得稳定细胞系。利用线粒体细胞色素氧化酶亚基I（COI）基因测序进行物种鉴定；通过秋水仙素处理和吉姆萨染色进行染色体核型分析；使用Lipo8000TM转染试剂将pEGFP-N1质粒导入细胞以评估转染效率。通过实时荧光定量PCR（qPCR）检测神经相关标记基因表达。采用CCK-8法评估不同浓度E2和11-KT处理对细胞活力的影响。最终以100 nM激素处理24 h，利用Illumina HiSeq 2500平台进行转录组测序，通过HISAT2比对、Salmon定量和DESeq2进行差异表达分析，并进行GO和KEGG富集分析。
四、研究结果
4.1 AJBC细胞系的建立与形态学特征
采用组织块贴壁法建立了日本鳗鲡脑原代细胞培养。组织块贴壁后约3-5天，细胞开始从组织块边缘径向迁移，呈现梭形或成纤维细胞样形态，逐渐增殖形成融合单层。经反复传代后，细胞保持相对均匀的形态并持续增殖，该细胞系被命名为AJBC。在连续传代过程中，细胞保持稳定的形态和生长速率，未观察到混合细胞群、异常肿胀、空泡化或生长迟缓现象。该细胞系已保藏于中国普通微生物菌种保藏中心（CGMCC No. 46802）。
4.2 AJBC细胞系的生长特性
在不同胎牛血清（FBS）浓度条件下，AJBC细胞在7天培养期内均持续增殖，但生长模式存在差异。15%和20% FBS组增殖较快，其中20% FBS组在第6天达到最高细胞密度。在不同培养温度条件下，27 °C培养的细胞从第2至第7天增殖逐渐加快，第7天达到最高细胞密度。结果表明，20% FBS和27 °C为AJBC细胞的常规传代提供了适宜条件。
4.3 AJBC细胞系的冷冻保存与复苏
AJBC细胞在含10%二甲基亚砜（DMSO）和血清的冻存液中冷冻保存后，复苏成功。台盼蓝排斥分析显示复苏后细胞活力持续高于70%，表明该细胞系适用于长期保存和后续使用。
4.4 AJBC细胞系的物种鉴定
从第30代AJBC细胞中扩增获得678 bp的线粒体COI基因片段，测序结果与NCBI数据库中日本鳗鲡COI序列的一致性超过99%，证实了该细胞系的物种来源。
4.5 染色体分析
对第30代AJBC细胞进行染色体分析，在100个分散良好的中期分裂相中，大多数细胞含有38条染色体（2n = 38），与日本鳗鲡已报道的二倍体染色体数目一致。
4.6 细胞转染与GFP表达
AJBC细胞经脂质体法转染GFP表达质粒后48 h，在荧光显微镜下观察到清晰的绿色荧光，转染效率约为35%，阴性对照细胞形态和活力正常，表明转染试剂未引起严重细胞毒性。
4.7 AJBC细胞的分子特征
与脑组织相比，AJBC细胞中sox2、map2和gfap的表达水平显著降低，其中map2和gfap表达极低。相反，nestin和col1a1在AJBC细胞中的表达水平显著高于脑组织。结果表明AJBC细胞可能代表一种具有神经相关特征的脑源基质样细胞模型。
4.8 E2和11-KT处理对AJBC细胞活力的影响
CCK-8检测结果显示，10和100 nM的E2或11-KT处理在整个实验期间对细胞活力影响相对稳定，而1000 nM的E2或11-KT显著降低细胞活力，且随处理时间延长降低更为明显。
4.9 AJBC细胞中性别类固醇激素受体的表达分析
E2处理显著上调esr1和esr2的表达水平。11-KT处理显著上调ar的表达，而对雌激素受体基因表达无显著影响。这证实了AJBC细胞具有类固醇应答特性。
4.10 AJBC细胞对E2和11-KT处理的转录组学分析
主成分分析（PCA）显示各组的生物学重复紧密聚集，激素处理组与对照组明显分离。差异表达分析鉴定出E2处理组3212个DEGs（1826个上调，1386个下调），11-KT处理组3522个DEGs（1974个上调，1548个下调）。KEGG富集分析显示，E2处理组的DEGs显著富集于细胞骨架相关和细胞黏附相关通路，包括肌细胞细胞骨架、整合素信号、黏着斑和细胞外基质（ECM）-受体相互作用，以及PI3K-Akt信号通路、肌动蛋白细胞骨架调控、MAPK信号通路和Hippo信号通路。11-KT处理组的DEGs显著富集于PI3K-Akt和MAPK信号通路，以及DNA复制、肌细胞细胞骨架、癌症中的微小RNA、ECM-受体相互作用、错配修复、整合素信号、黏着斑、核苷酸代谢和一碳叶酸库等通路。层级聚类分析显示，E2处理后igf2、igf1r、paqr9、thra1、ntf3、vipr2和ngfr等基因表达较高；11-KT处理后sox9、hsd3b7、fos、jun、leptin-B、drd3和htr2c等基因表现出差异表达。性别相关转录因子sox9和foxl2在性类固醇处理后表现出改变的表达模式。
4.11 RNA-seq结果的qRT-PCR验证
qRT-PCR验证结果显示，E2处理后htr2c、grik4、adra2db、jun、vipr2和drd3显著下调，igfbp6、sox9、igf1r、avpr1a、fos、igf2和hsd3b7显著上调；11-KT处理后adra2db、jun、vipr2、drd3、rspo1、htr2c和grik4显著下调，pgr、sox9、foxl2、igf1r、avpr1a、igf2和hsd3b7显著上调。qRT-PCR结果与RNA-seq表达趋势一致，验证了转录组数据的可靠性。
五、讨论与结论
讨论部分指出，AJBC细胞系具有连续培养、冷冻保存、复苏和基因操作的能力，为日本鳗鲡的细胞和分子研究提供了稳定的体外模型。尽管AJBC细胞来源于脑组织，但其成纤维细胞样形态和col1a1高表达表明其可能代表脑源基质样细胞群，而非典型的神经元或胶质细胞类型。转录组分析揭示了E2和11-KT处理引起的广泛转录变化，两种激素处理既有共享的应答通路（如ECM-受体相互作用、整合素信号、黏着斑、PI3K-Akt和MAPK通路），也有激素特异性通路（E2富集Hippo信号通路，11-KT富集DNA复制和核苷酸代谢），表明AJBC细胞能够在细胞水平整合不同的类固醇信号。IGF相关信号（igf1r和igf2）的差异表达可能将类固醇处理与PI3K-Akt和MAPK通路联系起来。sox9等性别相关基因的激素应答表达提示AJBC细胞保留了类固醇信号与生殖相关调控联系的部分分子组分，但不应被解释为性腺分化的证据。研究人员也指出，由于激素处理期间保留了20% FBS，血清中内源性类固醇激素的潜在贡献无法完全排除，未来使用类固醇去除血清的实验将有助于进一步区分外源E2和11-KT的直接效应。
研究结论：本研究建立并鉴定了一个稳定的日本鳗鲡脑源细胞系，并证明了其对E2和11-KT处理的应答性。转录组分析揭示了共享和激素特异性的应答，鉴定了参与类固醇应答细胞过程的候选信号通路和基因。尽管仍需进一步的功能验证，AJBC细胞为研究日本鳗鲡的性类固醇应答机制和相关的神经内分泌调控提供了有用的体外模型。
