慢性低温暴露对成年斑马鱼（Danio rerio）行为的影响

《Animals》：Effects of Chronic Low-Temperature Exposure on the Behaviour of Adult Zebrafish (Danio rerio)

　　

温度是影响鱼类行为与生理功能的主要环境因子。本研究将成年斑马鱼在18 °C下暴露21天，并与维持在26 °C的对照组进行比较，以评估慢性低温暴露的行为效应。研究采用四种基于个体的行为范式——新缸潜水测试（novel tank diving test, NTT）、明暗偏好测试（light–dark preference test, LDT）、社交偏好测试（social preference test, SPT）和镜像攻击测试（mirror biting test, MBT）——综合评估运动、探索、社交行为及焦虑相关反应。慢性暴露于18 °C与以下行为特征相关：不动时间增加、探索活动减少、底部停留时间增加、对镜像刺激的主动接触减少，而对同种的社交偏好基本保留。与先前报道的18 °C暴露4天后的行为反应相比，21天后仍可检测到若干行为差异，表明在检测的时间窗口内，维持在18 °C的鱼类其行为特征仍与对照组显著不同。由于每个温度条件仅由单个饲养缸代表，这些结果应被解读为在非重复缸体设计下的个体水平观察。先前在相同热条件下开展的研究显示，低温暴露也会改变大脑和眼睛中的蛋白质，提示温度可能同时影响神经和感觉系统。尽管本研究并非旨在将特定分子变化与特定行为直接关联，但分子改变和行为改变的持续存在提示了一种对低温的一致生物学反应。这些发现表明，与生存兼容的温度仍可显著影响行为，并可能对鱼类适应自然环境产生潜在后果。

**慢性低温暴露重塑成年斑马鱼行为表型：运动抑制与社交保留的跨范式证据**

**1. 研究背景与科学问题**

温度是影响变温动物生物学功能的核心非生物因子，直接调控鱼类的代谢、生长、免疫和行为表现。斑马鱼（Danio rerio）作为广泛使用的模式物种，其自然栖息地存在显著的昼夜和季节性温度波动，其热偏好温度约为26 °C，而生存温度范围可扩展至约4.5–42 °C。在气候变化的背景下，变暖效应受到广泛关注，但低温胁迫同样具有重要的生态相关性，可能源于季节波动、温度骤降或人为干扰。暴露时长是决定生物学反应性质的关键因素：急性暴露通常诱发快速代偿反应，而慢性暴露可能启动驯化过程，形成新的分子、生理和行为平衡。然而，鱼类对慢性低温的行为适应是否意味着完全恢复至对照状态，抑或形成一种持久的行为表型偏移，尚缺乏系统证据。已有分子数据显示，成年斑马鱼在18 °C慢性暴露下，脑蛋白质组和脂质组均发生显著重塑，而相同温度下的行为表型特征尚未得到系统刻画。因此，研究人员开展本研究，旨在评估21天18 °C慢性暴露对成年斑马鱼行为的影响，并与此前4天急性暴露的数据进行直接比较，以判断行为改变是否在延长暴露后持续存在。

**2. 研究设计与方法概述**

研究人员采用40只成年野生型斑马鱼（12月龄，雌雄比例约1:1），随机分配到两个家庭缸（每缸20只），分别作为实验组（18 °C）和对照组（26 °C），暴露持续21天。为最大程度保证与既往急性暴露数据的可比性，冷却速率、饲养条件、光周期、喂食方案和测试装置均与前期研究保持一致。行为评估采用四种成熟的个体范式：新缸潜水测试（NTT）、明暗偏好测试（LDT）、社交偏好测试（SPT）和镜像攻击测试（MBT），覆盖运动活性、垂直探索、焦虑相关反应、社交动机和刺激导向行为。每种测试持续10分钟，全程视频记录，使用ANY-maze?软件结合人工盲法评分。统计分析采用非配对双尾t检验（Welch校正），显著性阈值设为p ≤ 0.05。值得注意的是，由于温度操纵在缸体水平实施，每个温度条件仅有一个独立缸体，缺乏缸间重复，因此行为比较属于个体水平观察而非完全重复的缸体水平检验；性别未在个体水平记录，因此未纳入分析因素。

**3. 主要研究结果**

**3.1 新缸潜水测试（NTT）**

在NTT中，18 °C暴露21天的斑马鱼相比26 °C对照组表现出显著的不动时间增加和不动事件次数增多，提示低温下出现强化冻结样行为。垂直探索方面，低温鱼进入底部、中部和顶部三个区域的转换次数均显著减少，表明纵向运动活性下降。空间分布分析显示，低温鱼在底部区域停留时间显著延长，而中部和顶部停留时间显著缩短，呈现出增强的底部栖息倾向。

**3.2 明暗偏好测试（LDT）**

在LDT中，18 °C组在黑暗区域停留时间与对照组无显著差异，表明基础暗偏好未被明显改变；然而，低温鱼在明暗两区之间的转换次数显著减少，反映出探索行为受损。研究人员指出，对照组对黑暗区域的高基线偏好可能产生天花板效应，限制了该指标的敏感度。

**3.3 社交偏好测试（SPT）**

在SPT中，18 °C组的不动时间显著增加，但不动事件次数未显著改变。低温鱼在社交区与非社交区之间的转换次数显著减少，而在社交区停留时间与对照组无显著差异。这一结果表明，虽然整体运动活性下降，但接近同种的社交动机相对保留。不过，由于不动和运动减少的影响，社交区停留时间的未改变可能部分反映了到达社交区后活动降低的假象。

**3.4 镜像攻击测试（MBT）**

在MBT中，18 °C组表现出显著的不动时间增加、绝对转向角减小、进入镜像接近区的次数减少、镜像接近区内移动距离降低，以及镜像咬击次数减少。然而，在镜像接近区停留时间两方面无显著差异。这些结果提示低温暴露削弱了主动接触物种相关刺激的行为，但单纯的运动抑制可能解释部分观察到的差异。

**4. 讨论与结论**

讨论部分首先指出，慢性低温暴露的核心发现是行为活性和探索行为的多维度抑制，但现有证据表明这种抑制并非源于游泳能力受损，因为已有研究显示18 °C驯化三周的斑马鱼持续游泳表现甚至改善。研究人员将这种表型解释为自发探索减少和行为激活降低，而非单纯的运动缺陷。其次，与急性暴露数据相比，慢性暴露后的行为特征在定性上高度一致，增加的不动、减少的探索和增强的底部停留均持续至21天，提示鱼类可能通过建立新的行为平衡来实现低温驯化，而非完全恢复至对照状态。社交偏好方面，尽管运动活性下降，接近同种的时间未受损，结合先前 shoaling 研究结果，提示社交动机对低温具有相对抵抗力，可能构成应对不利热条件的适应策略。分子层面，既往蛋白质组学显示急性和慢性低温均显著改变脑内能量代谢、突触传递和神经递质相关通路，且慢性期仍有多条通路持续失调；眼睛蛋白质组也显示类似改变，提示热效应扩展至感觉结构。尽管分子与行为数据来自独立研究，不能直接建立因果关系，但其共同的持续性支持低温引发神经系统整体功能状态的重塑。生态学意义上，湖泊和河流中的低温事件可能迫使鱼类在维持生存的同时付出行为性能下降的代价，影响觅食、捕食者规避和资源竞争。研究局限包括缺乏缸间独立重复、性别未在个体水平记录、以及未评估生理和适合度指标。结论部分翻译如下：总之，本研究表明慢性暴露于18 °C与成年斑马鱼明显的行为特征相关，表现为不动时间增加、运动与探索活性降低、底部停留增强以及对镜像刺激的主动反应减弱。急性期观察到的若干行为差异在21天后仍可检出，说明低温相关效应超出了急性阶段，并在检测时间窗口内持续存在。对同种的吸引相对保留。然而，跨范式观察到的广谱运动活性降低应在解释社交区占用、探索和镜像导向终点时予以考虑。先前在可比热条件下的分子研究提供了相关生物学背景，显示慢性低温也改变脑和眼；然而，由于分子与行为测量来自独立研究，无法建立特定分子变化与个体行为终点的因果关系。总体而言，本研究表明，长期暴露于低温但非致死温度与斑马鱼行为的持续性多维差异相关。这些数据尚不能确定该表型代表不完全驯化、适应性调整还是失适应性反应。未来纳入独立缸级重复、个体性别鉴定以及互补的生理和生态相关终点的研究，将有助于阐明这些行为反应的机制和功能意义。