《Behavioural Brain Research》：Temporal profiles of apoptosis-related markers and locomotor recovery during repetitive transcranial magnetic stimulation after spinal cord injury in female rats
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摘要脊髓损伤（SCI）会引发一系列继发性损伤过程，其中细胞凋亡导致神经元丢失和功能恶化。重复经颅磁刺激（rTMS）是一种用于治疗脊髓损伤的有前景的非侵入性神经调控干预手段，但在既定疗程期间，与凋亡相关标志物的时间动态特征尚未得到充分表征。本研究采用改良Allen法在雌性大鼠中
摘要
脊髓损伤（SCI）会引发一系列继发性损伤过程，其中细胞凋亡导致神经元丢失和功能恶化。重复经颅磁刺激（rTMS）是一种用于治疗脊髓损伤的有前景的非侵入性神经调控干预手段，但在既定疗程期间，与凋亡相关标志物的时间动态特征尚未得到充分表征。本研究采用改良Allen法在雌性大鼠中建立脊髓损伤模型，于损伤后第2天开始给予主动rTMS或假刺激。实验动物按分组方案每日接受一次干预，直至预设终点。在连续干预3、7和14天后，分别评估分子标志物、免疫荧光、TUNEL染色、组织病理学及运动功能指标。脊髓损伤与Bax和剪切caspase-3表达升高、Bcl-2表达降低相关。与假刺激脊髓损伤动物相比，SCI+rTMS组在各考察干预终点均表现出更低的Bax表达，在干预7天和14天后表现出更低的剪切caspase-3表达和更高的Bcl-2表达。Caspase-8的Western blotting与免疫荧光结果存在差异，未能支持rTMS对其具有一致性调控作用。上述分子差异伴随损伤区域TUNEL阳性核每视野平均计数降低、空洞面积减小和保留组织面积增大的形态学证据，在各考察干预终点均可见此趋势，同时在14天干预终点观察到更高的BBB运动评分。总体而言，本研究描述了脊髓损伤后rTMS、凋亡相关标志物、损伤区域DNA链断裂标记与运动功能恢复之间的时序演变关系，但特定信号通路的因果关系仍有待确立。
引言
脊髓损伤（SCI）是一种严重的中枢神经系统疾病，常导致持续的运动、感觉和自主神经功能障碍，严重影响生活质量[1]。尽管手术管理和康复技术不断进步，但针对继发性损伤的有效策略仍然有限[2]、[3]。继发性损伤涉及多种病理过程，包括炎症、氧化应激和细胞凋亡，其中与凋亡相关的神经元死亡在组织损伤和神经功能障碍中发挥关键作用[4]。
凋亡信号通路在脊髓损伤后的继发性损伤中密切相关。损伤后，Bcl-2相关X蛋白（Bax）上调和B细胞淋巴瘤2（Bcl-2）下调破坏了促凋亡与抗凋亡信号之间的平衡，可能促进下游效应caspase（如caspase-3）的激活，从而加重组织损伤和功能缺陷[5]。Caspase-8作为一种与死亡受体信号相关的起始caspase，也可能参与脊髓损伤后的凋亡过程[5]。尽管抑制凋亡可减轻实验模型中的继发性损伤，但多数研究仅关注单一时间点或慢性阶段。因此，凋亡信号的时序动态特征及其对干预的反应性仍不完全清楚[6]、[7]、[8]，这限制了对靶向凋亡的阶段特异性治疗效果的评估。
重复经颅磁刺激（rTMS）是一种非侵入性神经调控技术，与神经可塑性、炎症和细胞死亡过程的变化相关，已应用于脑卒中、抑郁症和慢性疼痛等神经和精神疾病的治疗[9]、[10]、[11]、[12]、[13]。rTMS也在脊髓损伤中进行了研究，并据报道可减轻继发性损伤并改变凋亡相关信号[14]、[15]、[16]。然而，尽管已有抗凋亡效果的报道，但在既定rTMS疗程期间，各凋亡相关标志物的时序特征尚未得到充分表征。
因此，本研究在脊髓损伤大鼠模型中考察了rTMS干预期间凋亡相关标志物的时序特征。采用Western blotting和免疫荧光方法在连续干预3、7和14天后评估Bax、Bcl-2、剪切caspase-3和caspase-8的表达。同时还评估了损伤区域的TUNEL标记、脊髓组织病理学及运动功能，以考察这些分子变化与其时序关系。由于未进行通路特异性抑制、激活或挽救实验，本研究旨在表征时序关联而非建立因果信号机制。
章节摘要
动物与实验设计
54只雌性Sprague-Dawley大鼠（10–12周龄，体重210–230 g）购自安徽医科大学实验动物中心（许可证号：SCXK[皖]2017-006）。选择雌性大鼠是为了减少脊髓损伤术后管理相关的变异性，尤其是恢复期间所需的手动膀胱护理[17]。所有程序均符合ARRIVE指南，并经安徽医科大学实验动物伦理委员会批准（批准
各干预后时间点的凋亡相关蛋白表达变化
如图2所示，在各考察时间点，脊髓损伤均与凋亡相关蛋白表达的改变相关。干预3天后，SCI组与对照组相比，caspase-8、Bax和剪切caspase-3表达升高，Bcl-2表达降低。在该时间点，SCI+rTMS组与SCI组相比caspase-8和Bax表达更低，而Bcl-2或剪切caspase-3表达未见统计学显著差异
讨论
本研究考察了连续rTMS干预3、7和14天后的凋亡相关分子、组织病理学和功能性结局。与SCI组相比，SCI+rTMS组在干预3、7和14天后Bax表达更低，在干预7天与14天后Bcl-2表达更高、剪切caspase-3表达更低。上述分子发现伴随损伤区域TUNEL阳性核平均计数降低
结论
综上所述，在脊髓损伤雌性大鼠中，rTMS干预与干预3、7和14天后Bax表达降低相关，与干预7天和14天后Bcl-2表达升高及剪切caspase-3表达降低相关。上述分子发现在各考察干预终点均伴随损伤区域TUNEL阳性核减少、空洞面积减小及保留组织面积增大，并且在干预14天后观察到更高的BBB运动评分。
伦理声明
本研究遵循ARRIVE（动物研究：体内实验报告）指南进行。本研究经安徽医科大学实验动物伦理委员会批准。（批准号：LLSC20232177）
作者声明
本研究由安徽省教育厅资助（项目编号：2025syyj049）。
CRediT作者贡献声明
许清清和张钟福负责研究构思与设计；许清清、雷倩、杨梦雨、胡丹丹和刘金秀负责实验实施；许清清和李健负责数据分析；许清清、李健和陈禾木负责撰写和修改稿件。所有作者在提交前均已阅读并批准本文稿。
CRediT作者贡献声明
陈禾木：论文撰写—审阅与编辑，论文撰写—初稿撰写，监督指导，基金获取。胡丹丹：方法论，形式化分析。杨梦雨：方法论，数据整理。李健：论文撰写—初稿撰写，监督指导，调查研究。刘金秀：方法论，形式化分析。许清清：论文撰写—审阅与编辑，论文撰写—初稿撰写，方法论，形式化分析，数据整理，概念构思。雷倩：方法论，数据整理，概念构思。张钟福：论文撰写—
许清清|张钟福|雷倩|杨梦雨|胡丹丹|刘金秀|李健|陈禾木
