HEK293T细胞对聚集型淀粉样蛋白-β(1-42)的内化效率高于单体

《Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Proteins and Proteomics》：Aggregated amyloid-β(1-42) is internalized more efficiently than monomers by HEK293T cells

　　

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  HEK293T细胞模型是研究人类疾病机制的有价值工具。
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  与单体相比，HEK293T细胞对原纤维和纤维构象的淀粉样蛋白-β42（Aβ42）的摄取具有高度偏好性。
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  生物化学和成像策略使得对摄取Aβ42的详细分析成为可能。
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  摄取的Aβ42广泛分布于细胞质中。
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  Aβ42的荧光标记不会影响细胞摄取，并促进了流式细胞术的应用。
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  Aβ42的摄取过程涉及多种机制，其中巨胞饮作用优先摄取原纤维，而依赖动力蛋白的内吞作用优先摄取纤维。

引言

生物医学研究中最广泛使用的细胞系统之一是永生化的人类胚胎肾（HEK293T）细胞系 [1]、[2]。这些细胞的一个关键特征是表达SV40大T抗原，这使得携带SV40复制起始序列的质粒能够高效表达重组蛋白。贴壁上皮样HEK293T细胞高度可转染，且在培养中生长迅速、状态良好。另一个优势是缺乏（或低水平）许多内源性先天免疫蛋白，从而允许功能性细胞表面受体以及胞内复合物或通路的重组表达，用于机制研究。

HEK293T细胞被用于理解健康和疾病中的生物学过程，特别是神经退行性疾病中的淀粉样蛋白形成蛋白，如淀粉样蛋白-β肽（Aβ）、α-突触核蛋白（α-syn）和β2微球蛋白（B2M）。通过质粒转染将这些蛋白质基因导入HEK293T细胞，可生成胞内物种 [3]、[4]、[5]、[6]、[7]。相同的转染策略已被用于重建HEK293T细胞的关键胞内免疫通路或复合物，用于机制研究 [7]、[8]。在HEK293T细胞中表达非内源性细胞表面受体，展示了淀粉样蛋白形成蛋白对特定受体的刺激作用 [9]。此外，HEK293T细胞对Aβ和α-syn的直接摄取（无论是否进行转染）一直是理解胞内成核和聚集的重要途径 [4]、[5]、[6]、[10]、[11]。

Aβ是淀粉样蛋白-β前体蛋白（APP，P05067，A4_HUMAN）经β-和γ-分泌酶催化切割的产物，主要以40或42个残基的肽形式循环 [12]。Aβ，特别是Aβ42的产生以及随时间推移清除不足，最终可导致脑实质中由不溶性纤维状Aβ组成的细胞外神经纤维斑的形成和积累 [13]。多年来对Aβ聚集途径和物种的生物物理研究表明这是一个依赖于成核的过程 [14]，即单体可以非共价自组装产生多种构象和高阶聚集物种 [15]、[16]、[17]、[18]、[19]、[20]、[21]。向成熟纤维形成方向（在通路上或离通路）的中间产物基于离心被认为可溶，但在结构上可能存在差异。可溶性Aβ物种包括各种结构较少的寡聚物 [22] 以及结构更明确的富含β-折叠的原纤维 [17]、[18]、[23]。

Aβ的细胞摄取是AD发病机制的重要方面，无论是通过小胶质细胞吞噬 [24]、[25]、[26] 还是神经元内积累 [27] 和扩散 [28]。长期以来已知外源性Aβ可被细胞摄取并抵抗降解 [29]。所有摄取途径都受Aβ构象或聚集物种的影响。鉴于HEK293T细胞在探索AD和先天免疫之间的机制交汇方面发挥如此重要的作用，澄清该细胞模型系统中的Aβ摄取具有重要意义。这将有助于建立框架，用于未来研究摄取的Aβ42与内源性和/或重组表达的（例如重组表达的）先天免疫通路或蛋白质之间的胞内相互作用。关于HEK293T Aβ摄取过程，特别是与聚集状态和物种相关的问题仍有待解决。特定条件已被证明会显著差异化影响Aβ摄取 [10]、[11]。本报告利用多种方法确认了HEK293T对聚集物种（原纤维和纤维）的Aβ42摄取具有高度偏好性。这些信息对利用该有价值的HEK293T细胞模型系统进行基于Aβ的实验研究应大有裨益。

各部分摘要

细胞培养和处理

人胚胎肾细胞（HEK293T）购自ATCC（CRL-3216）。细胞在T-75培养瓶中于37 °C、5% CO₂ 条件下培养，使用Hyclone Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）生长培养基（ThermoFisher，SH3024302），含4 mM L-谷氨酰胺、1 mM丙酮酸、4.5 g/L葡萄糖和3.7 g/L碳酸氢钠。DMEM补充10%标准胎牛血清（FBS，Thermo Fisher，SH3008803）和50 U/mL青霉素/50 μg/mL链霉素（Hyclone，Thermo Fisher，SV30010）。

HEK293T细胞以构象依赖方式摄取Aβ42，通过ELISA测量

按照方法部分描述和先前报道 [20]、[23]、[30]、[31]、[32]、[33] 制备Aβ42原纤维、单体和纤维。4.5 kD SEC纯化的Aβ42单体（补充图1）是无结构的，不结合ThT，而通过SEC分离的可溶性原纤维（补充图1）和通过单体聚集和离心获得的不溶性纤维富含β-折叠结构，并引起ThT荧光 [20]、[23]、[30]、[31]。原纤维较短，结构较少的...

讨论

HEK293T细胞系是一个多用途且成熟的模型系统，适用于多种多样的生物学机制研究。HEK293T细胞极易转染，从而允许导入在这些细胞中不高度表达或不表达的蛋白质。这种能力允许构建受体、蛋白复合物或活性用于生物学和生物物理学研究。因此，对于与Aβ摄取相关的问题...

CRediT作者贡献声明

Cristina Sinobas Pereira：撰写-初稿、验证、方法论、调查、形式分析、数据整理。Heba Abid：调查、方法论。Candice Adair：调查。Ryan J. Domalewski：调查。Lana Jabr：调查。Michael R. Nichols：撰写-审阅与编辑、验证、监督、资源、项目管理、方法论、经费获取、形式分析、数据整理、概念化。

资金

本出版物中报告的研究由美国国家通用医学科学研究所（隶属国家卫生研究院）支持，资助号 R15GM152964（MRN）。内容完全由作者负责，不一定代表美国国家卫生研究院的官方观点。

利益冲突声明

作者声明，他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文所报告的工作。

Cristina Sinobas Pereira | Heba Abid | Candice Adair | Ryan J. Domalewski | Lana Jabr | Michael R. Nichols