基于5-HT介导的脑-肠-微生物群轴探讨羽叶丁香茎缓解失眠的作用及其物质基础

《Brain Research Bulletin》：The stems of Syringa pinnatifolia alleviate insomnia based on the brain-gut-microbiota axis mediated by 5-HT in mice and rats

　　

羽叶丁香（Syringa pinnatifolia）茎基于5-羟色胺（5-hydroxytryptamine, 5-HT）介导的脑-肠-微生物群轴减轻小鼠和大鼠的失眠症状。该研究首次报道了羽叶丁香发挥显著的催眠效应。含有三种主要木脂素类成分的酚类部位（phenolics, Ps）是该效应的主要贡献者。Ps通过5-羟色胺转运体（serotonin transporter, SERT）/色氨酸羟化酶（tryptophan hydroxylase, TPH）及5-HT_2C/磷脂酶Cβ1（phospholipase C beta 1, PLCβ1）信号通路调节5-HT水平。Ps可改善肠道菌群失调，并调节色氨酸-5-HT代谢。

失眠是最常见的睡眠障碍之一，其病理生理机制涉及神经递质系统、神经内分泌调节、昼夜节律信号、免疫应答及脑-肠-微生物群轴之间的复杂相互作用。5-羟色胺（5-hydroxytryptamine, 5-HT）作为睡眠-觉醒行为的重要调节因子，是连接中枢神经系统活动与肠道生理的潜在桥梁。中枢5-HT能信号直接参与睡眠与觉醒调控，而肠道是外周5-HT合成的主要场所，其功能受肠道微生物代谢的密切影响。羽叶丁香（Syringa pinnatifolia, SP）是内蒙古传统民族药物，其去皮根和茎在传统蒙古医学中用于治疗烦躁、心悸、心肌缺血及与khii紊乱相关的失眠。前期研究已系统考察了SP抗心肌缺血的药理作用基础，并初步发现其具有镇静或促睡眠活性。然而，SP化学组成复杂，其催眠活性的主要有效部位和活性成分仍不明确，相关生物学过程亦缺乏系统表征。因此，研究人员运用等质量等效传递（equal mass to equivalent effect transmission, EMEET）策略追踪SP的催眠活性物质，从脑-肠-微生物群轴角度系统阐明其作用机制。

研究人员以对氯苯丙氨酸（PCPA）诱导的失眠模型联合戊巴比妥钠睡眠实验，系统评价了SP提取物、各分离组分、亚组分及单体成分的催眠活性。结果首先证实SP总乙醇提取物T具有显著催眠作用。经EMEET策略指导的分馏，将T分离为30%乙醇洗脱部位N和95%乙醇洗脱部位M，M进一步分为I和M3，药效追踪显示N和M3为主要活性组分。进一步制备多糖部位（Poly）和酚类部位（Ps），发现Poly无催眠活性，而Ps具有明确催眠效果，从而将主要活性物质基础锁定为酚类部位。Ps经ODS柱色谱分为Ps-A、Ps-B和Ps-C三个亚组分，其中Ps-B和Ps-C均显示催眠活性；从Ps-B中分离鉴定了（–）-secoisolariciresinol（K）、alashinol F（F）、alashinol G（G）、berchemol及gentioluteol等主要成分。药理评价显示F、G、K均可显著缩短睡眠潜伏期和/或延长睡眠时间。机制研究方面，Ps在PCPA诱导失眠大鼠的下丘脑和结肠中降低SERT表达并升高TPH表达，提示其协调脑-肠轴的5-HT合成与重摄取过程；Ps还部分逆转了下丘脑5-HT_2C、Gαq/11和PLCβ1表达的异常改变。16S rRNA扩增子测序显示Ps可改善模型大鼠的肠道菌群失调，显著降低Bacteroidetes丰度，并回调Prevotella_9和Blautia等属水平。在野生型N2秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans, C. elegans）模型中，Ps上调了tph-1、cat-1、cat-4、mod-1、mod-5和ser-7等5-HT相关基因表达，并抑制头部摆动、增强咽部泵动率，进一步支持其5-HT能调节活性。该研究首次系统揭示了SP通过5-HT介导的脑-肠-微生物群轴发挥催眠作用。

本研究涉及的关键技术方法包括：（1）EMEET策略指导的活性追踪分馏，结合HPLC-MS化学表征与体内药效评价逐步锁定活性部位；（2）PCPA诱导失眠动物模型（雄性ICR小鼠与Wistar大鼠，均购自北京SPF生物技术有限公司）联合戊巴比妥钠睡眠实验评价催眠活性；（3）免疫荧光（IF）与蛋白质印迹法（Western blot）检测脑和结肠组织中SERT、TPH及5-HT_2C/Gαq/11/PLCβ1通路蛋白表达；（4）16S rRNA V3-V4区扩增子测序分析大鼠粪便肠道菌群组成；（5）C. elegans补充模型结合实时荧光定量PCR（RT-qPCR）检测5-HT相关基因表达。此外，采用旷场实验评估大鼠自发活动与探索行为。

研究结果分述如下：

3.1 SP提取物及组分对失眠小鼠的催眠作用：PCPA模型组睡眠潜伏期显著延长、睡眠持续时间显著缩短；总提取物T（80 mg/kg）显著缩短潜伏期并延长睡眠时间。分馏后，N和M3的活性与T相当，M作用较弱，I无显著效果，表明N和M3为主要活性组分，其成分以木脂素、苯乙醇苷及其糖苷、多糖等中高极性成分为主。

3.2 Ps的催眠作用：Ps（10和50 mg/kg）可显著缩短PCPA诱导失眠小鼠的睡眠潜伏期并延长睡眠时间，而Poly无显著活性，表明Ps是SP的主要催眠部位。

3.3 Ps的表征与分离：LCMS-IT-TOF分析显示Ps的色谱峰主要分布于保留时间7.5～17.5 min；从Ps-B中分离鉴定出K、F、G、berchemol和gentioluteol五种化合物。

3.4 Ps、亚组分及主要成分的催眠评价：Ps-B和Ps-C均表现出催眠活性。F（5 mg/kg）显著缩短睡眠潜伏期并延长睡眠时间；G（5 mg/kg）显著延长睡眠时间；K（5 mg/kg）显著缩短潜伏期并延长睡眠时间；而berchemol与gentioluteol混合物无催眠效果。

3.5 Ps对失眠大鼠脑和结肠5-HT相关蛋白的影响：模型组下丘脑和结肠SERT表达升高、TPH表达降低；Ps（14和28 mg/kg）显著降低SERT表达并升高TPH表达，免疫荧光结果进一步验证，提示Ps通过调节TPH与SERT协调脑-肠轴的5-HT合成与重摄取。

3.6 Ps对C. elegans生理和5-HT相关反应的影响：Ps（25–200 μg/mL）不抑制线虫体长，高浓度（200 μg/mL）反而促进生长；显著增加咽部泵动率并降低头部摆动频率。Ps（200 μg/mL）上调tph-1、cat-1、cat-4、mod-1、mod-5和ser-7基因表达，提示其通过增强5-HT合成、运输与受体信号发挥催眠相关作用。

3.7 Ps对失眠大鼠肠道菌群的影响：模型组OTU丰富度及Chao1指数降低，Ps（28 mg/kg）处理后呈恢复趋势；主坐标分析显示Ps组向对照组偏移。模型组Firmicutes丰度降低、Bacteroidetes升高，Ps显著降低Bacteroidetes丰度；属水平上，Ps显著降低Prevotella_9和Blautia的丰度。

3.8 Ps对下丘脑5-HT_2C/Gαq/11/PLCβ1信号的影响：模型组5-HT_2C和PLCβ1表达升高、Gαq/11表达降低；Ps（28 mg/kg）显著降低5-HT_2C和PLCβ1表达并升高Gαq/11表达，表明Ps可部分逆转PCPA诱导的相关信号通路异常。

讨论部分指出，EMEET策略为中药多组分药效物质研究提供了系统方法学框架，本研究将其成功拓展至失眠适应症。Ps作为多组分活性部位，其催眠作用涉及中枢与外周5-HT系统的协调调节、肠道菌群结构的改善以及下丘脑5-HT_2C/Gαq/11/PLCβ1信号通路的调控。肠道菌群改变可能通过短链脂肪酸（SCFA）及色氨酸代谢途径影响5-HT稳态，但该假设仍需进一步验证。研究结论认为，SP的催眠物质基础主要集中于酚类部位Ps，其机制与5-HT介导的脑-肠-微生物群轴调节密切相关。上述发现为SP治疗失眠的传统应用提供了实验依据，也为中药多功效物质基础研究提供了范例，并支持进一步评估其在失眠治疗中的转化潜力。