SiNAC2通过激活SiJAR1介导的茉莉酸信号加速谷子叶片衰老并调控产量性状

《The Crop Journal》：SiNAC2 accelerates leaf senescence and modulates yield traits in Setaria italica by activating SiJAR1-mediated jasmonate signaling

　　

本研究旨在鉴定谷子（*Setaria italica*）叶片衰老的调控机制。研究人员鉴定并功能表征了一个NAC转录因子SiNAC2，其表达随发育衰老梯度升高，能够结合并激活茉莉酸结合酶基因*SiJAR1*，而TIFY/JAZ蛋白SiTIFY3可减弱该激活作用。研究人员提出，SiNAC2通过转录激活*SiJAR1*促进叶片衰老，该过程受SiTIFY3的抑制。这些发现揭示了SiNAC2在叶片衰老过程中调控茉莉酸信号的一种转录机制，并为衰老调控与谷类作物农艺性状之间的关系提供了更深入的认识。

# 谷子叶片衰老与产量性状的调控机制：SiNAC2–SiJAR1–SiTIFY3模块的功能解析

## 1. 研究背景与科学问题

叶片衰老是植物发育的终末阶段，通过有序降解细胞结构和生物大分子，将老叶中的营养物质再 mobilization 至发育中的库组织，对谷物产量形成至关重要。茉莉酸（Jasmonates, JA）是促进年龄依赖性和逆境诱导叶片衰老的关键激素信号。具有生物活性的结合物茉莉酸-异亮氨酸（JA-Ile）被SCF^COI1复合体感知，引发JAZ/TIFY抑制蛋白降解，从而解除对下游转录因子（如MYC和NAC蛋白）的抑制，激活衰老相关转录程序。然而，衰老相关转录因子如何精细调控JA-Ile的合成，进而调节JA信号输出，仍不完全清楚。

NAC转录因子是连接激素信号与叶片衰老的核心调控节点。在谷子中，尽管已发现SiNAC1通过激活ABA生物合成促进衰老，但NAC转录因子是否通过调控JA合成途径参与衰老进程，此前尚无直接证据。此外，叶片衰老的进程与产量密切相关：早衰会缩短灌浆期、降低千粒重，而适度延迟衰老（如stay-green表型）有利于提高产量稳定性。因此，解析衰老调控的分子机制对作物遗传改良具有重要意义。

## 2. 研究策略与主要技术方法

研究人员以谷子品种‘Yugu1’进行发育转录组分析，筛选衰老相关NAC转录因子；利用‘Ci846’品种（易于遗传转化）通过农杆菌介导法获得过表达和CRISPR/Cas9突变体。主要技术方法包括：RNA-seq与qRT-PCR转录分析、亚细胞定位与转录激活活性检测（原生质体瞬时表达及酵母系统）、酵母双杂交（Y2H）与荧光素酶互补成像（LCI）、GST pull-down与免疫共沉淀（Co-IP）、染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）及ChIP-qPCR、电泳迁移率变动分析（EMSA）、酵母单杂交（Y1H）、双荧光素酶报告系统、靶向LC-MS/MS测定JA-Ile含量，以及BSMV介导的病毒诱导基因沉默（VIGS）。

## 3. 研究结果

### 3.1 SiNAC2的鉴定与功能表征

RNA-seq分析鉴定到候选衰老相关NAC转录因子Seita.1G209000（即SiNAC2）。其表达随发育阶段和空间衰老梯度升高，定位于细胞核并具有转录激活活性。

### 3.2 SiNAC2正调控年龄依赖性和暗诱导叶片衰老

*sinac2*突变体在年龄依赖性衰老中保持更绿的表型，叶绿素含量更高、离子渗漏率更低；而SiNAC2过表达（SiNAC2-OE）加速叶片黄化与衰老进程。暗处理实验进一步证实过表达加速衰老、突变体延迟衰老。

### 3.3 SiNAC2调控产量相关性状和籽粒成分

SiNAC2-OE植株表现为穗长增加、穗径和穗重降低，籽粒变细长，千粒重（TGW）下降；*sinac2*突变体穗部形态无显著变化，但籽粒长度增加、宽度和千粒重降低。籽粒成分分析显示SiNAC2-OE籽粒中蛋白质、总脂肪、支链淀粉和钙含量升高，而总淀粉、直链淀粉和叶黄素含量降低，支链/直链比增加，呈现“糯性”特征。

### 3.4 SiNAC2直接结合并激活SiJAR1启动子

ChIP-seq鉴定到2295个SiNAC2结合峰，其中35.69%位于转录起始位点上游1 kb内。*SiJAR1*启动子区域存在强结合峰。Y1H、EMSA和ChIP-qPCR证实SiNAC2直接结合*SiJAR1*启动子中的NACBS（CACG/CGTR）基序，双荧光素酶报告实验显示SiNAC2激活*SiJAR1*转录。启动子分段分析表明响应区域位于F1片段。

### 3.5 SiNAC2–SiJAR1模块促进JA-Ile积累和JA介导的衰老

SiNAC2-OE叶片中JA-Ile含量升高，*sinac2*突变体中降低；JA信号组分*SiMYC2*、*SiMYC3*表达相应上调或下调。MeJA处理下，SiNAC2-OE衰老加速且敏感性增强，*sinac2*突变体响应减弱。过表达*SiJAR1*（SiJAR1-OE）加速衰老，*sijar1*突变体延迟衰老，JA-Ile含量相应升高或降低，证实SiJAR1正调控衰老并维持JA-Ile稳态。

### 3.6 SiTIFY3与SiNAC2互作并减弱其对SiJAR1的激活

Y2H筛选鉴定到SiNAC2的互作蛋白SiTIFY3（Seita.3G034300）。LCI、GST pull-down和Co-IP证实二者在体内外直接互作。EMSA显示SiTIFY3不干扰SiNAC2与DNA的结合；双荧光素酶实验表明SiTIFY3抑制SiNAC2对*SiJAR1*启动子的转录激活，且SiTIFY3自身不结合也不激活该启动子。

### 3.7 SiTIFY3负调控暗诱导和MeJA诱导的衰老

SiTIFY3-OE叶片在暗处理下比WT更绿，叶绿素含量更高、离子渗漏率更低；BSMV-VIGS沉默*SiTIFY3*则加速暗诱导衰老。MeJA处理下，SiTIFY3-OE叶片敏感性降低，而沉默植株敏感性增强，说明SiTIFY3是JA信号的负调控因子。

## 4. 讨论与结论

### 4.1 SiNAC2通过激活JA-Ile合成基因SiJAR1促进叶片衰老

多种证据支持SiNAC2–SiJAR1模块的作用：不同基因型在MeJA和暗处理下的衰老表型差异、JA-Ile含量及相关信号基因表达的协同变化，以及SiNAC2直接结合并激活*SiJAR1*启动子的分子证据。ChIP-seq数据还提示SiNAC2可能参与ABA相关调控，但相关候选基因未在本研究中独立验证。

### 4.2 SiTIFY3在不影响DNA结合的条件下减弱SiNAC2–SiJAR1转录模块

SiTIFY3通过物理互作减弱SiNAC2的转录激活功能，而不干扰其启动子结合。其机制可能涉及招募共抑制复合物或干扰共激活因子募集，但具体分子细节有待阐明。该调控可能构成JA-Ile合成上游的额外调控层级，与JAZ蛋白再积累和JA-Ile降解等反馈机制互补。

### 4.3 SiNAC2对产量性状和籽粒品质的影响具有背景依赖性

SiNAC2影响衰老进程和粒型、粒重及籽粒成分，其表型效应受调控背景影响。本研究中过表达构建保留了天然miR164b识别位点，而既往报道的miR164b不敏感型SiNAC015变体可逃逸miRNA缓冲，导致穗部表型差异。这种定量化和背景依赖性调控解释了不同NAC家族成员在产量性状上的表型差异。

**研究结论**：本研究揭示了SiNAC2通过转录激活*SiJAR1*促进叶片衰老、并由SiTIFY3减弱该激活的分子机制，建立了NAC转录因子直接调控JA-Ile合成的新途径。该机制将发育年龄转化为分级激素输出，为理解衰老调控与谷类作物农艺性状的关系提供了新见解，并对通过精准调控衰老进程改良作物产量与品质具有潜在应用价值。