水稻OsMBTB3功能缺失增强抗旱性并改变ABA响应与泛素化修饰

《Environmental and Experimental Botany》：Loss of OsMBTB3 function enhances drought tolerance and alters ABA responsiveness and ubiquitination in rice

　　

本研究采用正向遗传学策略，鉴定出一个抗旱水稻突变体ditl3。研究发现，OsMBTB3功能缺失可增强水稻对渗透胁迫和干旱胁迫的耐受性。OsMBTB3蛋白与OsCUL3c在一个CUL3相关通路中发生相互作用。OsMBTB3突变增强了ABA响应基因的表达。OsMBTB3的功能与蛋白质调控及干旱适应机制密切相关。

研究背景与科学问题

干旱是全球范围内最严重的环境胁迫之一，严重制约植物的生长发育和作物产量。植物为应对干旱胁迫进化出了多种适应性机制，其中脱落酸（ABA）信号通路和活性氧（ROS）稳态调控是关键环节。ABA诱导气孔关闭以减少水分蒸腾损失，而ROS既可作为信号分子激活适应机制，过量积累又会导致氧化损伤。蛋白质泛素化作为一种重要的翻译后修饰（PTM），通过调控蛋白质活性、丰度和亚细胞定位维持细胞稳态。BTB（Broad Complex/Tramtrack/Bric-a-Brac）蛋白作为CUL（cullin）类E3泛素连接酶的底物特异性适配器，参与靶蛋白的多聚泛素化。然而，水稻中仅含MBTB（MATH and BTB）结构域的蛋白与CUL的关联及其在干旱应答中的功能尚不清楚。为此，研究人员提出假设：OsMBTB3可能通过调节ABA信号和CUL3介导的蛋白质泛素化途径，作为水稻抗旱性的负调控因子发挥作用。

研究方法概述

研究人员从伽马射线诱变的水稻突变体库中分离获得抗旱突变体ditl3，利用全基因组重测序（WGRS）鉴定致病突变。通过CRISPR/Cas9技术创制osmbtb3敲除突变体进行功能验证。采用酵母双杂交（Y2H）、双分子荧光互补（BiFC）和体外pull-down实验检测蛋白质相互作用。通过体外无细胞泛素化实验评估泛素化修饰。运用RT-qPCR分析ABA和干旱响应基因表达。结合生理生化指标测定（包括相对含水量RWC、气孔导度、抗氧化酶活性等）全面评价突变体的抗旱表型。

研究结果

3.1 ditl3对干旱胁迫的响应

与野生型（WT）相比，ditl3突变体在空气干燥和20% PEG处理下表现出显著更高的存活率和生长性能。PEG处理后，ditl3叶片中叶绿素含量更高，可溶性糖和脯氨酸积累量也显著高于WT，表明其代谢响应发生改变。

3.2 脱水胁迫下的萌发反应和生长表现

在低水势条件下（-0.75 MPa），ditl3种子6天内达到100%萌发率，而WT仅为79%。ditl3幼苗鲜重在胁迫条件下显著高于WT，表明其萌发期和早期生长阶段的耐渗透胁迫能力增强。

3.3 ditl3植株抗旱性增强且农艺性状维持良好

生殖期干旱胁迫后，ditl3植株株高显著增加，每穗粒数和成熟率均显著高于WT。千粒重在对照条件下ditl3显著高于WT，干旱胁迫下两者无显著差异。穗长、秆长和总小穗数在两基因型间无显著差异。

3.4 ditl3在干旱胁迫下ABA响应性和气孔调节增强

ditl3叶片在脱水过程中维持显著更高的相对含水量（RWC）。外源ABA处理延迟了ditl3种子的萌发速率，并更显著地抑制其芽长和根长，表明ditl3对ABA敏感性增强。两基因型气孔密度无显著差异。

3.5 ditl3基因组测序及OsMBTB3的分离与鉴定**

全基因组重测序鉴定出一个位于OsMBTB3基因（LOC_Os03g57854）编码区的16-bp缺失（GAGTCCGGCCCCTACA），导致移码突变和提前终止密码子（OsMBTB3p.Glu141fs）。该截短蛋白仅保留MATH结构域，丧失BTB和BACK结构域。

3.6 OsMBTB3的亚细胞定位和表达分析

OsMBTB3和OsMBTB3p.Glu141fs均定位于细胞质和细胞核。OsMBTB3在萌发种子中表达最高，营养生长期叶鞘和叶片中表达量也较高。空气干燥处理诱导OsMBTB3转录水平升高，9小时达峰值。

3.7 OsMBTB3与OsCULs的相互作用

Y2H筛选显示OsMBTB3与OsCUL1-2和OsCUL3c相互作用。BiFC和pull-down实验进一步证实OsMBTB3与OsCUL3c存在物理互作，但与OsCUL1-2无互作。OsMBTB3p.Glu141fs因缺失BTB结构域而丧失与OsCUL3c的结合能力。通过Y2H筛选鉴定出潜在底物蛋白OsDOLK1（一种含有SEC59超家族保守结构域的磷酸多萜醇激酶）。BiFC、Y2H和pull-down实验均证实OsMBTB3与OsDOLK1存在物理互作，而OsMBTB3p.Glu141fs无法与之结合。

3.8 OsMBTB3参与OsDOLK1的泛素化调控

体外无细胞泛素化实验表明，当使用WT总蛋白提取物时，OsDOLK1发生多聚泛素化修饰；而使用ditl3突变体蛋白提取物时未检测到泛素化信号，证明OsCUL3–OsMBTB3复合体介导了OsDOLK1的泛素化修饰。OsDOLK1在干旱胁迫下转录水平无明显变化，在各组织器官中均有表达，1周龄叶片中表达最高。

3.9 OsMBTB3功能缺失增强渗透胁迫耐受性

CRISPR/Cas9创制的osmbtb3敲除突变体在PEG处理后表现出与ditl3一致的抗旱表型：叶片更绿、存活率更高、总叶绿素含量更高、节间和第三叶长度、根长、地上部和根部鲜重均显著优于WT。

3.10 ditl3和osmbtb3的脱水诱导气孔导度变化**

脱水10分钟后，osmbtb3的气孔导度显著低于WT；20分钟时，两个突变体均显著低于WT。两个突变体的蒸腾速率在脱水10、20和30分钟时均显著低于WT，表明OsMBTB3功能缺失促进脱水早期的气孔快速关闭。

3.11 ditl3和osmbtb3在渗透胁迫下氧化损伤减轻、抗氧化酶活性增强**

渗透胁迫下，两个突变体地上部和根部的H₂O₂和丙二醛（MDA）积累量均低于WT，而抗坏血酸过氧化物酶（APX）和过氧化氢酶（CAT）活性则显著高于WT。

3.12 OsMBTB3功能缺失增强ABA和干旱响应基因表达

脱水处理期间，ditl3和osmbtb3中SnRK2亚家族II成员（OsSAPK1、OsSAPK2、OsSAPK3）和III成员（OsSAPK8、OsSAPK9、OsSAPK10）的转录本水平较WT更强烈地上调。下游ABA响应基因OsAREB1、OsAREB2和OsAREB8的表达也在突变体中呈现更强的诱导趋势。

讨论与结论

研究表明，ditl3突变体通过提高渗透调节物质（可溶性糖和脯氨酸）积累、增强抗氧化酶活性、减少氧化损伤、改善水分保持能力等多重机制实现抗旱性增强。OsMBTB3作为CUL3类E3泛素连接酶的底物适配器，通过与OsCUL3c形成复合体介导底物蛋白OsDOLK1的泛素化修饰。OsMBTB3功能缺失导致ABA和干旱响应信号通路中关键组分（SnRK2s和AREBs）的转录激活增强，同时促进脱水早期气孔更快关闭以降低蒸腾失水。这些发现揭示了OsMBTB3作为水稻抗旱性负调控因子的分子机制，为培育抗旱水稻品种提供了新的遗传靶点和理论依据。