《Environmental Pollution》：Towards predictive biomonitoring: integrating machine learning and ecological thresholds to identify potential foraminiferal molecular indicators of salmon farm impacts
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•有孔虫群落沿鱼笼距离分布而转移，受干扰严重区域与受干扰较轻区域之间存在较高水平的分类学变化。•机器学习有助于识别鲑鱼养殖有机富集影响下潜在有孔虫生物指示物。•多样性指标和有孔虫指示物可追踪有机富集梯度，支持用于海洋生物监测的可扩展环境DNA工具。引言环境DNA（eDNA）宏
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有孔虫群落沿鱼笼距离分布而转移，受干扰严重区域与受干扰较轻区域之间存在较高水平的分类学变化。
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机器学习有助于识别鲑鱼养殖有机富集影响下潜在有孔虫生物指示物。
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多样性指标和有孔虫指示物可追踪有机富集梯度，支持用于海洋生物监测的可扩展环境DNA工具。
引言
环境DNA（eDNA）宏条形码技术作为一种强大的生物多样性评估方法已应运而生，它能够在无需直接形态鉴定（Taberlet等人，2018；Pawlowski等人，2022）的情况下同时检测多个物种。该方法包括从环境基质中提取、扩增和测序DNA，这些环境基质包括水体（de Vargas等人，2015）、土壤（Raimbault等人，2026）、沉积物（Dell'anno和Danovaro，2005；Torti等人，2018）以及大气（Lynggaard等人，2022），支持跨空间和时间尺度的评估。通过捕获丰富物种和稀有物种（包括在形态学上难以识别的隐存物种或幼体阶段），eDNA宏条形码技术克服了传统形态调查的许多局限性。
基于这些方法学优势，eDNA宏条形码技术在估计生物多样性和相对生物量方面已被证明极为有用（Ershova等人，2021；Klunder等人，2022），在评估生态系统生态质量状况（EcoQS）方面具有价值（Cordier等人，2021；Barrenechea Angeles等人，2023），在识别潜在生物指示物方面具有优势（Pochon等人，2015；Robinson等人，2022；Nguyen等人，2023），在推断生物指数和生态质量指标方面具有应用前景（Frontalini等人，2025；Raimbault等人，2026），并且在为资源管理和公共卫生提供标准化工具方面具有潜力（Kelly等人，2023）。将DNA宏条形码技术与无分类学方法（Apotheloz-Perret-Gentil等人，2017）和基于模型的推理框架（Cordier等人，2018；Fruhe等人，2021）相结合，被认为是环境评估的一种强大策略，且不依赖于传统分类学鉴定。在该框架下，预测模型（例如机器学习算法）直接在无分类学的序列特征上进行训练，从而允许对EcoQS或环境梯度进行稳健的推断（Cordier等人，2018；Wilkinson等人，2024）。这些方法也可用于通过将序列变异体或基因组特征与特定环境条件关联起来来识别生物指示物（Pawlowski等人，2024；Rubel等人，2025）。随着eDNA技术的快速发展，整合无分类学策略可以最大化高通量测序数据的信息量，强化其在评估人为压力对海洋生态系统影响方面的潜力。
海洋生态系统的健康状况通常使用生物指示生物进行评估（Carignan和Villard，2002）。对于底栖群落而言，EcoQS评估主要依赖于多毛类群落生物指数的计算，如AMBI——AZTI海洋生物指数（Borja等人，2000）或挪威敏感性指数（Rygg和Norling，2013）。底栖有孔虫是单细胞介形生物，被广泛认为是环境变化的敏感指示物（Alve，1995；Murray，2009；Frontalini和Coccioni，2011）。为捕获这些响应，已开发了多种基于有孔虫的生物指数，用于评估沿海海洋环境的EcoQS，包括耐受种指数（Barras等人，2014）、有孔虫压力指数（Dimiza等人，2016）、有效物种数exp(H'bc)（Bouchet等人，2012）以及Foram-AMBI（Alve等人，2016）。然而，所有这些指数均基于形态学物种鉴定，这种方法耗时、成本高且难以大规模推广（Carugati等人，2015；Bruce等人，2021）。它们通常还忽略了在干燥沉积物样本中未能保存的隐存物种或软体分类群（Frontalini等人，2020；Singer等人，2023；Nguyen等人，2026b）。
在过去三十年中，DNA条形码和宏条形码技术作为强大的分子工具应运而生，彻底革新了有孔虫的鉴定和多样性研究（Pawlowski和Holzmann，2014）。通过靶向小亚基18S rRNA基因中标准化的超变区，DNA条形码技术促进了底栖有孔虫统一参考数据库的开发和持续改进，从而实现了更精确的分类学鉴定和跨研究的可比性分析（Holzmann等人，2024）。然而，宏条形码研究发现，大量有孔虫物种仍是未知的，其中大多数为软壁或裸体单室有孔虫（Pochon等人，2015；Pawlowski等人，2016；Nguyen等人，2023），这表明这些研究较少的类群有可能被利用作为环境条件的潜在生物指示物。使用靶向18S rRNA基因特定区域的有孔虫特异性引物（Pawlowski和Lecroq，2010），可以检测扩增子序列变体（ASVs）或操作分类单元（OTUs），随后可利用各种统计和生态学方法进行分析，以识别潜在的生物指示分类群并开发或改进已有的生态指数（Pochon等人，2015；Keeley等人，2018；Cavaliere等人，2021）。
为了从宏条形码数据中识别与环境参数相关的生物指示物，已应用了多种分析方法。总体而言，这些方法可归纳为两种互补策略：统计建模和基于机器学习的框架。在第一种策略下，统计关联分析使用相关性分析（Brinkmann等人，2023）、指示值统计（Turon等人，2022；Nguyen等人，2026b）或差异丰度检验（Godoy-Lozano等人，2018；Cortez-Cervantes等人，2024）等方法，评估ASV/OTU的分布或丰度与环境梯度之间的关系。其中，阈值指示分类群分析（TITAN）是一种替代方法，它识别连续环境梯度上的群落水平阈值，并据此评估单个分类群丰度响应（Baker和King，2010）。第二种策略包括基于机器学习的方法，特别是从分类树和集成模型中导出的变量重要性度量，如支持向量机或随机森林（RF）回归（Liu等人，2022；Pawlowski等人，2024），用于识别最能区分环境类别或梯度的变量（ASVs/OTUs）（Fruhe等人，2021）。随后可以进一步检查这些被选中的变量，以识别可能作为环境变化指示物的单个ASV/OTU。在实际应用中，统计方法和机器学习工具可以同时应用于同一eDNA数据集，对它们的输出结果进行比较或整合（Leontidou等人，2023；Rubel等人，2025）。评估这些互补方法所识别分类群的交叉重叠程度可以衡量其稳健性和一致性，允许对候选指示物进行交叉验证，减少特定方法引入的偏差，并增强对所选生物指示物反映真实生态响应而非单一分析方法产生的伪像的置信度。
在本研究中，我们利用有孔虫特异性37F-18S rRNA标记的eDNA宏条形码技术，评估受鲑鱼养殖影响的海洋沉积物中底栖有孔虫群落的响应，并识别潜在的分子指示物。我们使用先进的生物信息学分析来：(1) 表征有孔虫群落结构；(2) 使用统计和预测建模方法（即RF回归和TITAN）识别指示有机富集的分类群；(3) 探究这些分类群与沉积物有机富集梯度的关系。通过这一方法，我们进一步推进了分子工具在环境监测框架中的应用，并支持养殖影响沿海生态系统的可持续管理。
章节摘要
采样、DNA提取、PCR扩增与测序
本研究基于对2015年至2019年间从挪威沿岸十家鲑鱼养殖场采集的274个沉积物样本的分析（表S1和图S1）。采样按照国家合规监测方案（挪威环境监测标准NS 9410）进行，该方案是挪威底栖监测调查中常规使用的方法。关于采样过程、形态分类学分析和环境参数测量的详细描述已
环境背景与序列数据概述
本研究共纳入222个eDNA样本，这些样本从十家鲑鱼养殖场的沉积物中成功提取并经过后续处理分析（图S1），覆盖了与鲑鱼养殖影响相关的广泛环境梯度。样本分布于不同的EcoQS类别中，包括高（n=8）、好（n=148）、中等（n=10）、差（n=28）和极差（n=28），并跨越了从鱼笼0到1530米不等的距离梯度。161个沉积物样本提供了总有机碳（TOC）测量数据。
鲑鱼养殖对底栖有孔虫群落的影响
我们的结果证实，底栖有孔虫群落的多样性和组成受鲑鱼养殖活动及当地环境条件的强烈影响，这一规律在传统形态学研究和eDNA宏条形码分析中均得到了一致观察（Grouazel等人，2026；Pawlowski等人，2014；Pochon等人，2015；Pawlowski等人，2016；He等人，2019）。从eDNA数据推断的有孔虫α多样性在采样点
结论
我们的研究突出了与机器学习相关的方法在评估养殖对底栖有孔虫群落环境影响方面的潜力。多样性和分类学模式的转移沿有机富集梯度被观察到，不同的有孔虫类群在受严重干扰和受干扰较轻的地点占主导地位。通过整合RF和TITAN，我们识别了潜在的基于ASV的指示物，这些指示物同时得到了预测重要性和生态学响应阈值的支持。
CRediT作者贡献声明
Ngoc-Loi Nguyen：撰写——审阅与编辑，撰写——初稿，可视化，验证，方法学，调查研究，形式分析，数据整理，概念构思。Justyna Falkowska：方法学，调查研究，数据整理。Joanna Paw?owska：撰写——审阅与编辑，验证，资源，项目管理，方法学，数据整理。Fabrizio Frontalini：撰写——审阅与编辑，验证，方法学，数据整理。Jan Paw?owski：撰写——审阅与编辑，撰写
资金
本研究部分由欧盟BIOcean5D项目（资助协议号#101059915）资助。然而，本文表达的观点和意见仅为作者本人所有，不一定反映欧盟的立场。无论是欧盟还是资助机构，均不对其承担责任。
利益冲突声明
作者声明以下可能存在潜在利益冲突的经济利益/个人关系：Jan Pawlowski报告与ID-Gene Ecodiagnostics的关系，包括：董事会成员资格。如有其他作者，他们声明没有已知的竞争性经济利益或个人关系可能影响本文所报告的工作。
致谢
我们感谢Tristan Cordier和Adrià Antich在数据分析期间提供的宝贵见解和有益讨论。
Ngoc-Loi Nguyen | Justyna Falkowska | Joanna Paw?owska | Fabrizio Frontalini | Jan Paw?owski
