通过提高内源性含硫氨基酸供应以提高利用毛酵母中S-腺苷甲硫氨酸和谷胱甘肽的生物合成

《Food Bioscience》：Improved S-adenosylmethionine and glutathione biosynthesis in Candida utilis via elevated endogenous sulfur-containing amino acid supply

　　

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  MET15 作为正调控因子，调控C. utilis中SAM和GSH的生物合成。
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  C. utilis中MET15过表达提高了内源性含硫氨基酸的供应。
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  MET15-OE在不外源补充含硫氨基酸的情况下，增加了SAM和GSH的协同生产。
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  MET15缺失抑制了酵母细胞生长以及SAM和GSH的生物合成。

引言

S-腺苷甲硫氨酸（SAM）和谷胱甘肽（GSH）是两种关键的含硫生物活性分子，在生物体中发挥着不可或缺的生理功能（Chu等，2013；Li等，2004）。SAM作为体内主要的甲基供体，参与几乎所有涉及DNA、RNA、蛋白质和脂质的甲基化反应，从而调控细胞增殖、表观遗传修饰和代谢稳态（Chen等，2025；Doxtader等，2018；Ouyang等，2020）。GSH是细胞内主要的抗氧化剂，能够清除活性氧物种，减轻氧化损伤，并参与细胞解毒和免疫调节（Dr?ge & Breitkreutz，2000；Ferreira等，2023）。鉴于SAM和GSH多样的生物学功能，它们已被广泛应用于功能食品、制药和化妆品行业（Asantewaa & Harris，2021；Lee等，2023；Sarkar等，2025；Wang等，2026）。

SAM和GSH的生物合成与硫代谢网络和含硫氨基酸合成途径紧密偶联，其中L-甲硫氨酸和L-半胱氨酸作为核心前体和关键调控节点（Thomas & Surdin-Kerjan，1997；Yan等，2026b）。SAM由L-甲硫氨酸和ATP经甲基转移酶（MAT）催化的单步反应合成（Chen等，2016；Lu，2000）。相比之下，GSH的生物合成涉及两步连续的ATP依赖性酶促反应：首先由γ-谷氨酰半胱氨酸合酶（γ-GCS）催化L-谷氨酸与L-半胱氨酸缩合形成γ-谷氨酰半胱氨酸（γ-GC），随后谷胱甘肽合酶催化添加甘氨酸完成GSH的形成（Gasmi等，2024；Li等，2004；Lu，2013）。在酵母细胞中，这些前体的合成始于无机硫的同化，随后依次合成同型半胱氨酸和L-甲硫氨酸（Brosnan等，2007；Cai等，2023）。L-甲硫氨酸进一步腺苷化生成SAM（Liao等，2026），而L-半胱氨酸作为硫代谢途径的关键下游产物，是GSH合成的限速前体（Gao等，2026）。然而，复杂的多步反应级联和严格的代谢反馈抑制严重限制了野生型菌株中SAM和GSH的天然生物合成效率（Santos等，2022；Tan等，2025）。为突破这一瓶颈，目前实现SAM和GSH高产的主要策略包括优化发酵条件、增强关键代谢通量、削弱竞争途径以及减轻限速酶的反馈抑制（Hu等，2025；Li等，2020；Shao等，2010；Wang等，2024；Xiao等，2024；Zhang等，2026）。然而，大多数常规改造方法无法从根本上克服上游含硫氨基酸途径带来的代谢限制（Prigent等，2024）。因此，挖掘和工程化调控硫代谢的核心功能基因对于实现SAM和GSH的同时高产至关重要，MET15基因已成为一个有前景的调控靶点（Chen等，2018）。

MET15基因编码O-乙酰-L-高半胱氨酸硫醇酶（EC 2.5.1.49），是酵母上游含硫氨基酸合成途径中的关键限速酶（Mohr等，2023）。该酶特异性催化无机硫化物与O-乙酰高半胱氨酸（OAH）缩合生成同型半胱氨酸（Finkelstein & Martin，2000），后者是连接L-甲硫氨酸和L-半胱氨酸生物合成的核心中间体（Brosnan & Brosnan，2006）。现有研究表明，MET15的表达水平直接决定下游含硫氨基酸的生物合成通量，MET15敲除容易导致营养缺陷型菌株（Obando Montoya等，2014；Viaene等，2000）。迄今为止，关于MET15的研究主要集中在模式生物Saccharomyces cerevisiae中的功能验证（Kaplan等，2024；van Oss等，2022），较少研究探讨其在SAM和GSH生物合成中的调控机制，而非模式生物Candida utilis中的相关研究更为匮乏。

细胞内含硫氨基酸前体是酵母中SAM和GSH生物合成的关键限制因素（Gasmi等，2024；Liao等，2026）。外源补充L-甲硫氨酸和L-半胱氨酸可有效增加细胞内前体池并促进SAM和GSH的生物合成（Wang等，2012）。然而，这些氨基酸的高成本显著增加了发酵费用（Cheng等，2025；Wang等，2026），从而阻碍了其大规模工业化应用。相比之下，通过遗传改造增强内源性前体合成可以稳定富集细胞内含硫氨基酸池，无需额外添加剂，是实现SAM和GSH高效协同生产的经济且可持续的策略。

基于上述背景，本研究针对C. utilis中的关键基因MET15进行遗传改造，以调控含硫氨基酸代谢的上游通量。首先构建了MET15基因缺失或过表达的工程菌株。基于分批培养实验，分析了改造菌株中细胞内前体的积累变化和代谢通量分布，并进一步阐明了MET15改造驱动SAM和GSH生物合成提高的生理机制。鉴于C. utilis是公认安全（GRAS）酵母，本研究的结果有望为食品工业中含硫代谢物的生产提供一个可行的酵母细胞工厂。

章节摘要

微生物、培养基和培养条件

野生型酵母C. utilis CCTCC M 209298被用作母株（PS）。通过同源重组构建了三种工程菌株，包括MET15缺失（met15Δ）、MET15过表达（MET15-OE）和MET15互补（met15Δ::MET15）。

菌种培养在500 mL Erlenmeyer锥形瓶中进行，使用酵母浸膏-蛋白胨-葡萄糖（YPD）培养基（20 g/L葡萄糖，10 g/L酵母浸膏，20 g/L蛋白胨，pH 6.0），在30°C、200 rpm条件下摇床培养24小时。

MET15缺失、过表达和互补菌株的构建

针对MET15的遗传操作生成了C. utilis的基因缺失（met15Δ）、过表达（MET15-OE）和互补（met15Δ::MET15）菌株。通过菌落PCR（图S3–S5）和qRT-PCR（图S6）确认了成功构建和基因型验证。光学显微镜（400×，图S7）和扫描电镜（3,000×，图1）观察18小时培养物，发现改造菌株与母株之间没有明显的形态学差异，表明MET15改造不影响

讨论

SAM和GSH是有价值的含硫生物活性化合物，被广泛用作功能食品添加剂（Al-Temimi等，2023；Chu等，2013）。为实现其绿色生物合成，食品级酵母菌株作为微生物细胞工厂优于化学合成路线。在食品生产的GRAS微生物中，S. cerevisiae是最广泛使用的SAM和GSH过量生产的工程底盘（Chen & Tan，2018；Yan等，2026a），而C. utilis表现出更优越的

结论

本研究利用同源重组技术在GRAS酵母C. utilis中改造了关键硫代谢基因MET15。MET15过表达提高了细胞内含硫氨基酸前体的积累，增强了MAT和γ-GCS的活性，改善了能量再生，并将碳通量重新分配至含硫代谢物，从而显著促进了SAM和GSH的生物合成。MET15-OE菌株的补料分批培养实现了SAM和GSH的强化协同生产。

CRediT作者贡献声明

Yanyu Wei：撰写——初稿，调查研究，数据整理。Gongyuan Wei：撰写——审阅与编辑，监督指导，经费获取，概念构思。Dahui Wang：验证，方法学。Chonglong Wang：方法学，数据整理。Feitong Zhang：调查研究，数据整理。Tingting Li：方法学，调查研究，数据整理。

数据可用性

数据将根据请求提供。

利益冲突声明

所有作者声明，他们不存在已知可能影响本论文报告工作的竞争经济利益或个人关系。

致谢

本研究得到国家自然科学基金（22378284）和苏州大学大学生创新训练计划项目（202510285091）的资助。

Yanyu Wei|Tingting Li|Feitong Zhang|Chonglong Wang|Dahui Wang|Gongyuan Wei