乳酸菌发酵对铁皮石斛汁抗氧化活性与结构特性的影响研究

《Food Chemistry: X》：Fermentation of Dendrobium officinale juice using lactic acid bacteria and evaluation of its antioxidant and structural properties

　　

本研究探讨了单菌及共培养乳酸菌(LAB)发酵对铁皮石斛(Dendrobium officinale)汁抗氧化能力、结构特性及香气特征的影响。研究人员采用植物乳杆菌(Lactiplantibacillus plantarum, LP)、副干酪乳杆菌(Lacticaseibacillus paracasei, LPC)和瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus, LH)分别进行单菌发酵及二元组合(LP-LPC、LP-LH、LPC-LH)发酵。研究运用综合分析平台，包括总酚含量(TPC)、总黄酮含量(TFC)、2,2-二苯基-1-苦肼基(DPPH)与2,2′-联氮-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(ABTS)自由基清除实验、顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用(HS-SPME-GC/MS)、电子鼻(E-nose)、衰减全反射-傅里叶变换红外光谱(ATR-FTIR)、X射线衍射(XRD)及共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)，以评估发酵诱导的改性。乳酸菌发酵以菌种依赖性方式显著增强了抗氧化特性(p < 0.05)。其中，LPC-LH共培养组(D6)表现出最高的TPC(492.38 mg GAE/mL)和TFC(545.78 mg QE/mL)，较对照组分别提高近五倍和四倍。此外，D6组表现出最强的DPPH(72.58%)和ABTS(84.44%)自由基清除活性。气相色谱-质谱(GC-MS)分析揭示了显著的挥发性成分重构，其特征为有机酸、甘油及含氮代谢物的增加，尤其在共培养体系中表现突出。电子鼻主成分分析(PCA)解释了总方差的94.45%，清晰区分了各处理组(p < 0.05)。结构分析表明，混合培养体系中蛋白质构象发生显著变化且半结晶度增加，而共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)证实了广泛的基质破坏和孔隙率增强。本研究强调了乳酸菌，尤其是共培养体系，在优化铁皮石斛汁营养特性方面的潜力，为其作为功能性发酵饮料的开发奠定了基础。

**论文解读：乳酸菌发酵对铁皮石斛汁抗氧化活性与结构特性的影响**

**1. 研究背景与目的**

随着全球范围内糖尿病、胃肠道疾病、心血管疾病及氧化应激相关疾病发病率的持续攀升，寻求安全、可持续的干预策略已成为研究热点。传统药物治疗存在副作用、长期依赖性和高成本等局限，促使研究者日益关注基于植物源的功能性食品。铁皮石斛(Dendrobium officinale)作为兰科植物，在传统中医药中享有盛誉，其茎部富含水溶性多糖(约占干重20–45%)、酚类、黄酮、生物碱及氨基酸等生物活性成分，具有抗氧化、抗炎、免疫调节及降血糖等多种药理活性。然而，既往对铁皮石斛的研究多聚焦于代谢组学整体变化或单一菌株发酵效应，缺乏对不同乳酸菌(LAB)单菌及共培养发酵对其抗氧化特性、蛋白质结构修饰、色泽属性、结晶度及微观结构特征的系统比较评估。基于此，本研究旨在系统探究单菌及二元共培养乳酸菌发酵对铁皮石斛汁生物活性成分、抗氧化能力及结构特性的影响，并整合多种互补分析技术(ATR-FTIR、XRD、CLSM、GC-MS和电子鼻)同时评估发酵在化学、微观结构、结构及香气水平上诱导的改变，为铁皮石斛功能性发酵饮料的开发提供理论依据。

**2. 研究方法概述**

研究人员采用了多种关键技术手段以全面评估发酵效果。样本来源于中国浙江杭州当地市场的新鲜铁皮石斛茎，经清洗、打浆、过滤后制备成汁。三种商业化乳酸菌菌株(植物乳杆菌LP、副干酪乳杆菌LPC、瑞士乳杆菌LH)购自中国北京SynBio Tech公司，经活化培养至10⁷–10⁸ CFU/mL后，以2%(v/v)接种量于37°C、60 rpm条件下发酵48小时。分析手段包括：(1)采用Folin-Ciocalteu法和硝酸铝比色法分别测定总酚含量(TPC)和总黄酮含量(TFC)；(2)采用DPPH和ABTS自由基清除实验评估抗氧化活性；(3)采用顶空固相微萃取(HS-SPME)结合气相色谱-质谱联用(GC-MS)分析挥发性代谢物；(4)采用电子鼻(E-nose)结合主成分分析(PCA)区分香气特征；(5)采用衰减全反射-傅里叶变换红外光谱(ATR-FTIR)结合酰胺I带去卷积分析蛋白质二级结构；(6)采用X射线衍射(XRD)评估结晶度变化；(7)采用共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)结合FITC-ConA凝集素染色观察微观结构。所有实验设三次生物学重复和三次技术重复，数据采用单因素方差分析(ANOVA)和Tukey HSD检验(p < 0.05)。

**3. 研究结果**

**3.1 抗氧化活性**

研究结果表明，乳酸菌发酵以菌种依赖性方式显著提高了铁皮石斛汁的抗氧化性能。所有发酵处理组的TPC、TFC及DPPH和ABTS自由基清除活性均高于未发酵对照组(D0)。在单菌发酵中，植物乳杆菌(D1)的效果优于副干酪乳杆菌(D2)和瑞士乳杆菌(D3)。然而，混合培养发酵的效果最为显著，其中LPC-LH共培养组(D6)表现出最高的TPC(492.38 mg/L)和TFC(545.78 mg/L)，较对照组分别提高约五倍和四倍。整体抗氧化活性顺序为D6 > D5 > D4 > D1 > D2 > D3 > D0，与酚类和黄酮含量呈正相关，表明多酚富集与抗氧化能力之间存在明确的功能一致性。研究推测，发酵过程中乳酸菌产生的β-葡萄糖苷酶、酯酶等水解酶可能促进结合态酚类物质释放，但具体酶促机制未被直接验证。

**3.2 GC-MS分析**

GC-MS分析显示，发酵引起了铁皮石斛汁挥发性及半挥发性代谢物谱的显著物种依赖性生物转化。与未发酵对照(D0)相比，所有发酵处理组(D1-D6)均表现出显著成分变化，且共培养发酵(D4-D6)比单菌发酵(D1-D3)产生更广泛、更强烈的化学修饰，暗示了协同代谢互作。发酵样品的一个显著特征是含氮杂环化合物和胺类(如吡啶和哌啶衍生物)的出现，这些物质在对照组中几乎不存在，可能与乳酸菌的蛋白水解活性及随后的氨基酸分解代谢有关。醛类物质如烟碱醛在各发酵处理中持续上升，D6组含量最高(13%)。甘油和槲皮醇的显著增加归因于乳酸菌协同的碳水化合物代谢酶系统。羧酸及其衍生物在发酵后成为优势化学类别，如壬酸(D6中31%)和草酸(D6中13%)在D0中为微量成分，发酵后显著增加。共培养处理组显示更高的代谢强度，表明菌种间存在交叉互养作用。

**3.3 色泽特性**

发酵显著改变了铁皮石斛汁的色泽属性。与D0相比，所有发酵处理组(D1-D6)的L\*值(亮度)、a\*值(红度)和b\*值(黄度)均出现显著向外扩张，表明发酵提高了亮度并强化了红、黄色调。共培养处理组(D4-D6)的表现比单菌发酵更为突出，其中D6的色泽变化最为显著。总色差(ΔE)显示所有发酵样品均出现明显颜色偏移，且与一些报道的发酵后褐变不同，本研究中亮度增加表明色素释放和基质澄清优于褐变反应。

**3.4 ATR-FTIR与蛋白质二级结构**

ATR-FTIR分析显示，所有样品在3500–3000 cm^?1(O-H伸缩)、2920–2850 cm^?1(C-H伸缩)、1700–1500 cm^?1(酰胺I和II区)和1200–900 cm^?1(C-O-C伸缩和糖苷键)区域呈现特征吸收带。酰胺I带去卷积分析表明，未发酵样品(D0)β-折叠和α-螺旋比例较高，蛋白质结构较为有序。单菌发酵(D1-D3)引起α-螺旋含量轻度下降，β-转角和无规卷曲增加，表明蛋白质部分解折叠。混合培养(D4-D6)则表现出更明显的α-螺旋和β-折叠含量降低，β-转角和无规卷曲含量大幅增加，其中D6的变化最为显著(p < 0.05)，表明共培养微生物作用引起了更强的蛋白水解效应和结构重排。

**3.5 XRD分析**

XRD图谱显示，未发酵样品(D0)呈现宽泛弥散的衍射峰，反映出以无定形结构为主的特性。经单菌发酵(D1-D3)后，衍射强度在10–30°范围内明显增强，并出现微弱峰，表明部分结构重排。混合菌株发酵(D4-D6)产生更显著的改变，所有混合处理在15–30°之间呈现更尖锐、强度更高的峰，表明增强的分子有序性和生物聚合物部分结晶化。其中LPC-LH(D6)处理表现出最高的峰强度和最清晰的衍射峰，显示最强的结构重排和半结晶形成。这一现象可归因于混合菌株协同酶解多糖和蛋白质，导致复杂无定形结构分解后重组为更有序的排列。

**3.6 CLSM观察**

共聚焦激光扫描显微镜定性地揭示了发酵样品与对照组之间荧光标记颗粒结构的空间组织和荧光分布的差异。D0呈现相对均匀、致密的荧光标记颗粒结构。单菌发酵组中，LP(D1)显示松散的排列，LPC(D2)表现出更显著的荧光再分布，LH(D3)引起局部变化但保留相对聚集结构。混合菌株样品(D4-D6)表现出比单菌更显著的荧光分布和颗粒组织修饰，其中D6表现为高度分散的颗粒特征和荧光再分布。这些观察表明共培养发酵与更大的结构空间组织变化相关，但由于未使用多糖特异性荧光探针且未进行定量图像分析，这些变化仅作为定性证据。

**3.7 电子鼻分析**

电子鼻联合主成分分析可清晰区分不同发酵处理，PC1、PC2和PC3分别解释总方差的63.94%、19.92%和10.59%，累计达94.45%。未发酵对照(D0)与发酵处理组分离明确。D5(LP-LH)和D6(LPC-LH)在PC1和PC2方向表现出最显著的迁移，表明香气改变程度最大。雷达图显示，发酵处理在W1W(含硫化合物和萜烯)、W2W(含硫有机化合物)、W5S(氮氧化物)等传感器响应强度显著增强，表明含硫和含氮挥发性物质的增加。共发酵样品D5和D6表现出最高的传感器响应，与PCA结果一致，显示产生了更复杂的挥发性化合物谱。

**4. 总结与结论**

本研究综合运用多重分析技术，系统评估了单菌及共培养乳酸菌发酵对铁皮石斛汁的多维度影响。结果表明，乳酸菌发酵以菌种依赖性方式显著提高了铁皮石斛汁的总酚、总黄酮含量及DPPH和ABTS自由基清除活性，其中LPC-LH共培养组合(D6)效果最佳。GC-MS和电子鼻分析证实发酵显著重构了挥发性代谢物谱，共培养体系表现出更深的氨基酸分解代谢和更复杂的香气特征。ATR-FTIR和XRD分析揭示了共培养条件下更显著的蛋白质构象变化和半结晶度增加，CLSM则提供了微观结构变化的定性证据。研究局限性包括未直接监测发酵过程中的活菌数、pH和可滴定酸度，未直接测定蛋白水解活性，以及CLSM图像仅定性分析等。总体而言，本研究填补了菌株特异性及协同发酵机制在铁皮石斛汁中应用的研究空白，证明乳酸菌共培养发酵，特别是LPC-LH组合，能显著改善铁皮石斛汁的功能性、结构及香气特性，为其作为功能性发酵饮料的开发奠定了基础。