《Food Chemistry: X》：Novel ternary covalent complexes (OsrhLF-EGCG-mal) based on plant-derived recombinant lactoferrin (OsrhLF) by polyphenol-carbohydrate dual-modified strategy
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摘要专业翻译
本研究基于植物源重组乳铁蛋白（OsrhLF），采用多酚-碳水化合物双重修饰策略，制备了一种新型的OsrhLF-EGCG-麦芽糊精（Mal）三元共价复合物。该复合物通过表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）与麦芽糊精（Mal）的协同共价修饰构建而成。
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本研究基于植物源重组乳铁蛋白（OsrhLF），采用多酚-碳水化合物双重修饰策略，制备了一种新型的OsrhLF-EGCG-麦芽糊精（Mal）三元共价复合物。该复合物通过表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）与麦芽糊精（Mal）的协同共价修饰构建而成。研究人员建立了三元复合物与短链脂肪酸（SCFAs）代谢之间的关联性。实验结果表明，该共价三元复合物有效增强了苹果表面的持水能力。该研究不仅解决了乳铁蛋白在食品体系中应用的关键局限性，还拓展了基于OsrhLF的功能性食品研发路径，为其工业化应用提供了新的技术支持。
论文解读文章
一、研究背景与科学问题
乳铁蛋白（LF）是一种单链球状糖蛋白，作为乳源性蛋白中的关键活性成分，具有免疫调节、抗菌、铁结合及抗氧化等多种生物学功能，对婴幼儿生长发育尤为重要。然而，天然乳铁蛋白面临供应瓶颈：人源乳铁蛋白制备成本高昂，牛源乳铁蛋白（bLF）从牛奶中提取的产量有限，难以满足大规模应用需求。为此，多项研究证实LF已在微生物、植物和动物等多种生物表达系统中成功表达，为解决天然LF高成本和低产量问题提供了极具前景的技术途径。然而，与广泛使用且安全的bLF相比，植物源重组乳铁蛋白（OsrhLF）的研究相对匮乏，亟待深入探索。此外，LF对环境条件变化高度敏感，包括pH、离子强度、酶活性和温度等。为克服这一局限，近期研究表明，利用食物中天然存在的活性成分如膳食多酚和碳水化合物对LF进行共价修饰，可有效增强LF的结构稳定性和功能活性，为其应用瓶颈提供可行解决方案。
二、研究目的与意义
本研究以bLF为参照，引入植物源重组OsrhLF，与EGCG和Mal合成三元共价复合物。研究人员进一步分析了LF-EGCG-Mal共价复合物在反应机制、结构、理化性质及功能特性方面的差异，并通过体外消化模型和粪便发酵实验，探究其营养特性差异、对短链脂肪酸（SCFAs）代谢的影响以及在食品保水方面的作用。该研究不仅弥补了乳铁蛋白在食品体系应用中的关键短板，也拓展了OsrhLF在食品化学领域的工业应用前景。
三、关键技术方法
- 1.
三元共价复合物制备方法：采用两步法，首先在碱性条件下（pH 9.0，25℃持续搅拌24小时）使EGCG氧化并与LF形成共价键，经透析去除未反应游离多酚后，再通过湿热美拉德反应（pH 11.0，75℃加热6小时）将Mal接枝到LF-EGCG复合物上，最终冻干获得LF-EGCG-Mal共价复合物。
- 2.
自由氨基含量测定：采用邻苯二甲醛（OPA）法，于340 nm处测定吸光度，评估共价反应程度。
- 3.
光谱表征：使用荧光分光光度计测定荧光光谱（激发波长295 nm，发射波长300-500 nm），并以纳米粒度分析仪测定Zeta电位。
- 4.
抗氧化活性评价：综合采用DPPH自由基清除法、ABTS+自由基清除法和FRAP铁还原能力法进行评估。
- 5.
体外模拟消化实验：依据INFOGEST标准模型，分别模拟胃相（含胃蛋白酶，37℃振荡2小时）和肠相（含胰酶，37℃振荡2小时），采用BCA法测定LF消化率，福林酚法测定EGCG释放率。
- 6.
体外粪便发酵与SCFAs测定：收集SPF级BALB/c、C57BL/6和KM小鼠（5-6周龄，雌雄各半，来自华中农业大学实验动物中心，伦理批准号HZAUMO-2025-0229）的混合粪便，在厌氧条件下发酵72小时，采用气相色谱-质谱联用（GC/MS）结合DB-FFAP极性柱测定乙酸、丙酸、丁酸等SCFAs含量。
- 7.
鲜切苹果应用实验：将苹果切片浸泡于不同样品溶液中1小时后，在6小时内定时称重记录水分损失变化。
四、研究结果
3.1 自由氨基含量变化
通过OPA法测定发现，与未处理的LF相比，热处理的LF（H-LF）、LF-EGCG和H-LF-EGCG-Mal的自由氨基含量均显著降低，且H-LF-EGCG-Mal低于LF-EGCG。这表明EGCG可能与LF侧链氨基形成了C-N共价键，而Mal的加入进一步消耗了LF-EGCG复合物中的ε-氨基或末端氨基酸α-氨基，导致自由氨基含量显著减少。研究人员推测可能的反应机制为：碱性条件下EGCG酚羟基被氧化成醌类，与LF的氨基或巯基侧链形成C-N或C-S共价键；随后，LF-EGCG聚合物的游离氨基与Mal的还原端发生美拉德反应，经希夫碱、阿马多里产物等阶段最终形成LF-EGCG-Mal共聚物。
3.2 基本特性变化
3.2.1 荧光光谱变化
bLF和OsrhLF均在约334 nm处呈现强荧光发射峰。热处理后，H-OsrhLF的荧光强度显著低于H-bLF，可能归因于H-OsrhLF溶液不稳定易聚集。与H-LF相比，H-LF-EGCG-Mal共价复合物的荧光强度几乎完全猝灭，表明LF侧链色氨酸的氨基同时参与了与EGCG和Mal的共价反应，三者间的强相互作用显著降低了LF的荧光量子产率。此外，热处理后LF的最大发射波长（λmax）从334 nm红移至约339 nm，说明LF结构展开，色氨酸残基暴露使其环境疏水性降低。
3.2.2 Zeta电位变化
加热后，LF的净电荷由正变负，这可能归因于热诱导结构展开暴露出带负电的残基。总体而言，H-LF-EGCG-Mal复合物的Zeta电位绝对值显著增加至约-30 mV，表明三元复合物溶液的稳定性增强。净负电荷的增加可归因于EGCG和Mal的共价结合消耗了LF中带正电的氨基酸残基。
3.3 抗氧化活性变化
与LF相比，H-LF的DPPH清除活性降低。而与H-LF相比，LF-EGCG和H-LF-EGCG-Mal的DPPH、ABTS+自由基清除活性及FRAP铁还原能力均显著提高，且H-LF-EGCG-Mal略高于LF-EGCG。这表明EGCG和Mal的共价协同效应显著增强了LF的抗氧化能力。EGCG作为有效的氢原子或电子供体，与LF共价结合引入了大量酚羟基抗氧化基团，可有效中和多种自由基；同时Mal糖基化产生的中间产物和美拉德褐变产物也具有自由基清除活性，且美拉德反应产物可作为金属螯合剂降低过渡金属浓度，从而发挥抗氧化作用。值得注意的是，H-OsrhLF-EGCG-Mal的铁还原能力强于H-bLF-EGCG-Mal，提示OsrhLF具有更高的铁含量。
3.4 消化特性的影响
随着消化时间延长，各组样品的消化率逐渐升高。bLF和OsrhLF的胃消化率分别为66.67%和62.27%，肠道消化率分别达到79.83%和88.72%。热处理后，bLF在各阶段的消化率均高于未加热组，而OsrhLF则呈相反趋势，可能是由于OsrhLF易形成不溶性沉淀抑制消化酶水解。在三元共价复合物中，bLF-EGCG-Mal和OsrhLF-EGCG-Mal的最终消化率仅为46.50%和47.88%，表明EGCG和Mal对LF具有良好的保护作用。这归因于多糖Mal和多酚EGCG与消化酶的相互作用，以及LF-EGCG-Mal作为高分子量聚合物降低了酶的可及性。此外，在整个胃肠消化阶段，EGCG缓慢释放，bLF-EGCG-Mal和OsrhLF-EGCG-Mal的最终释放率分别为64.04%和65.71%，提示LF可作为EGCG的递送系统实现缓释效果。
3.5 短链脂肪酸变化的影响
在BALB/c小鼠粪便发酵体系中，0-24小时乙酸、丙酸和丁酸含量仅略有增加，直至48小时仍维持在较低水平，72小时时各类SCFAs含量显著上升。与LF相比，三元复合物组的各种SCFAs产量相对较低，可能是因为LF-EGCG-Mal三元复合物结构复杂稳定，不易被特定酶降解并释放小分子物质，因而难以被肠道菌群利用。C57BL/6小鼠粪便发酵液中乙酸、丙酸、丁酸和总酸的增加趋势与BALB/c小鼠相似。而在KM小鼠粪便发酵系统中，早期SCFAs生成较慢但呈逐渐增加趋势，尤其在48小时发酵阶段，LF-EGCG-Mal三元复合物组的丙酸和丁酸含量显著增加，但48小时后呈下降趋势，与前两种小鼠的变化模式不同。
3.6 鲜切苹果中的应用
不同处理组苹果切片的重量变化随时间延长而增加，表明鲜切苹果细胞在加工过程中受损，导致蒸腾作用加剧和水分散失。蒸馏水处理组在6小时后的质量变化最大，水分损失最高。OsrhLF和hLF组的效果相近且均优于蒸馏水组。H-OsrhLF-EGCG-Mal处理组效果最佳，有效减缓了鲜切苹果的水分流失，更好地维持了其含水量。与LF组相比，bLF-EGCG-Mal组的水分损失更少，表明三元复合物能形成有效屏障延缓水分蒸发。研究人员推测，LF的成膜性、EGCG的交联能力和Mal的填充效应及亲水性共同发挥了协同作用：LF构建膜骨架实现物理屏障，EGCG通过交联增强膜层致密度以减少水分渗透通道，Mal则填充膜层孔隙并吸附表面自由水。
五、总结与讨论
本研究证明，多酚-碳水化合物双重修饰通过构建OsrhLF-EGCG-Mal三元共价复合物，协同改善了植物源重组乳铁蛋白（OsrhLF）的理化和功能特性。重要的是，该研究有效解决了乳铁蛋白在食品体系中直接应用的关键局限性，从而拓展了基于LF的功能性食品研发路径，并为OsrhLF的工业化应用提供了新的技术支撑。然而，未来仍需进一步研究以解决含LF三元复合物功效的个体差异问题，这将有助于满足功能性食品开发和水果保鲜中的个性化应用需求，并进一步推动基于重组乳铁蛋白的食品化学复合物的实际应用。
