山羊乳清来源的新型鲜咸双味肽：味觉受体互作机制与低钠调味应用潜力

《Food Chemistry: X》：Novel dual-taste umami and salty peptides from goat whey: Mechanism and interaction with taste receptors

　　

从山羊乳清中发现了具有鲜味和咸味双重功能的新型肽。其关键的鲜味机制是通过ALA176、ASN150、LYS155、GLN222、Asp219和LYS5残基与T1R1/T1R3受体结合。肽通过静电相互作用和氢键与TMC4相互作用，而咸味感知主要由亮氨酸、苯丙氨酸和甲硫氨酸与TRPV1通道的结合介导。该研究为天然风味增强剂和食盐替代品提供了分子基础。

山羊乳清来源的新型鲜咸双味肽：机制解析与味觉受体互作研究解读

一、研究背景与意义

近年来，食品工业对天然咸味和鲜味风味化合物的需求持续增长。山羊乳清是奶酪生产的关键副产物，全球年产量达1.8亿至1.9亿吨，富含3.5%–3.8%的高品质蛋白质、4.6%的乳糖以及钙、磷等矿物质。然而，目前大部分山羊乳清被降级用作饲料或肥料，其高营养价值未得到充分利用。山羊乳清富含A2型β-酪蛋白、乳铁蛋白和免疫球蛋白，在释放具有功能和风味特性的肽方面具有独特优势。然而，现有关于乳清肽的研究主要集中在苦味肽和生物活性肽方面，例如Sebald等人利用QQQ-MS和SWATH-MS技术鉴定奶酪中的苦味肽，Estévez等人通过水解制备具有ACE抑制和抗氧化活性的乳清肽并应用于酸奶。乳清蛋白来源的肽同时具备功能性和风味特性的潜力在很大程度上尚未被探索。

传统上，咸味由氯化钠等无机盐提供，鲜味由谷氨酸提供。近年研究表明，肽作为氨基酸的链接体可产生鲜、甜、酸、苦或咸等不同味觉。这些肽的咸味与鲜味特征之间存在显著相关性，源于其协同感知机制，使其成为低钠食品中增强咸味感知的理想选择。因此，寻找同时具有咸味和鲜味的双味肽已成为主要研究方向。已有研究从酵母提取物、花生蛋白、金华火腿、蛤蜊和鸡肉等来源中鉴定出具有增咸或增鲜作用的肽，但山羊乳清来源的鲜味肽尚未被探索。

分子对接已成为研究配体-受体相互作用和阐明味觉感知分子机制的有力工具，被广泛用于表征肽与鲜味受体T1R1/T1R3以及咸味受体TMC4和TRPV1的潜在相互作用。然而，分子对接过程中未观察到蛋白质和配体的构象变化，因此需要分子动力学模拟来获取空间和时间尺度上的原子轨迹，提供蛋白质构象变化和波动的详细信息。乳清蛋白来源的鲜咸双味肽的构效关系仍缺乏充分表征。因此，将分子对接与分子动力学模拟相结合，可能为这些肽与鲜味受体T1R1/T1R3及咸味相关离子通道TMC4和TRPV1的潜在相互作用提供更深入的见解，有助于阐明其双味特性的分子基础。

二、研究内容概述

本研究聚焦于山羊乳清来源的咸鲜味肽，利用肽组学鉴定其序列并阐明其结构基础，采用电子舌评价其味觉强度和协同效应，通过分子对接分析肽与T1R1/T1R3和TRPV1味觉受体的潜在结合。该综合方法为山羊乳清来源的咸鲜味肽的风味呈现和潜在受体互作机制提供了理论见解，支持其未来在低钠食品中的应用。

三、主要关键技术方法

研究人员采用超滤分级获得三个分子量组分（>10 kDa、3–10 kDa和<3 kDa），通过感官评价筛选出鲜味最强的U3组分（<3 kDa）。利用UPLC-MS/MS非靶向代谢组学鉴定非挥发性代谢物，采用nano-LC-MS/MS（timsTOF Pro2质谱仪）进行肽段鉴定，共鉴定出130个蛋白质和2383条肽段。通过多模型联合虚拟筛选（PeptideRanker、UMPred-FRL、Umami_YYDS、TastePeptides-Meta）结合毒性、致敏性、水溶性和稳定性预测，筛选出6条候选肽。合成肽经感官评价、电子舌（SA402B）、定量描述性分析（QDA）和时间强度（TI）分析验证。采用同源建模构建T1R1/T1R3异源二聚体，以AlphaFold数据库获取TMC4结构，以PDB ID 5IS0获取TRPV1晶体结构，使用AutoDock Vina 1.2.3进行分子对接，并使用AMBER 24软件（ff14SB力场）进行100 ns全原子分子动力学模拟。

四、研究结果

4.1 超滤组分的感官特征

通过超滤获得三个组分（>10 kDa、10–3 kDa和<3 kDa）。感官评价显示，U3组分的鲜味最强（5.4分），其次是U2（3.5分），U1最弱。咸味方面，U3（2.9分）显著高于U1（1.5分）。低分子量化合物是鲜味的关键贡献者，因此选择U3进行进一步分析。

4.2 UPLC-MS代谢物分析

在U3组分中共鉴定出173种代谢物，其中有机酸及其衍生物（34.1%）、氨基酸及其衍生物（28.9%）和糖类及其衍生物（12.7%）最为丰富。关键有机酸如柠檬酸、苹果酸和乳酸可与无机离子及鲜味、甜味氨基酸协同增强整体鲜味感知。脯氨酸和茶氨酸等氨基酸及其衍生物通过特定官能团与味觉受体相互作用，对鲜味形成至关重要。此外，Leu-Leu和Ile-Leu等二肽通过稳定结合钙敏感受体显著增强鲜味厚度和持续性，Arg-Ala通过增加味蕾细胞对NaCl的响应频率表现出明显的增咸效果。甜菜碱赋予海鲜特征风味，脂质可能延长鲜味持续性。

4.3 山羊乳清中肽的鉴定

质谱分析显示山羊乳清中有130个蛋白质和2383条肽段。分子量分析显示63.11%的序列低于1.5 kDa。链长分析表明44.40%（1058条肽）含7–10个残基，48.80%（1163条肽）含11–15个残基。疏水性残基（Leu、Val、Ala）在N端高度富集，而Lys主导C端。493条肽的C端含阳离子残基（Lys、Leu、Thr、Arg），65条肽含N端Glu，赋予两性离子特性，可能增强与T1R1/T1R3受体的静电相互作用。36.2%的肽末端含Lys或Leu，该基序已被报道可通过激活G蛋白偶联信号增强咸味感知。

4.4 潜在双味肽的虚拟筛选

采用短肽（≤10个氨基酸，分子量<1500 Da）与多个鲜味肽预测数据库相结合的综合筛选策略。基于PeptideRanker>0.5筛选出242条肽，经多模型交叉验证获得42条潜在鲜味肽，最终通过安全性、溶解性和稳定性评估筛选出6条肽：GAKDMWRA（GA-8）、SGKDPNHF（SG-8）、PLFKGMTRP（PL-9）、ADKYFHA（AD-7）、GQGAKDMWRA（GQ-10）和AGQGAKDMWR（AG-10）。这6条肽均具有高水溶性、无毒性和非致敏性。

4.5 感官评价

感官分析显示，所有6条合成肽均具有多种风味属性。AD-7的鲜味强度最高（4.2分），其次是PL-9（3.8分）、GQ-10（2.9分）、GA-8和AG-10（均为2.8分）、SG-8（2.2分）。AD-7（3.0分）和PL-9（2.1分）的咸味显著高于其他肽。检测阈值范围为0.20至0.53 mmol/L。GA-8、PL-9、AD-7和GQ-10表现出较低的检测阈值（0.2–0.25），表明这4条肽具有增强的味觉感知灵敏度。

电子舌分析显示，AD-7的鲜味强度最高（4.02分），其次是GQ-10（3.40分）和PL-9（3.31分）。AD-7的优异鲜味强度可能归因于其较低的分子量，有利于受体结合。PL-9虽缺乏典型鲜味氨基酸却表现出明显鲜味，表明其空间构象和与味觉受体的特定相互作用可能决定感知强度。咸味方面，AD-7得分最高（6.35分），其次是GQ-10（5.00分）。AD-7的强咸味可能与其C端天冬氨酸有关，该残基已被报道为咸味肽的关键特征。

QDA分析显示，所有4条肽均显著增强MSG溶液的鲜味强度，AD-7的鲜味增强作用最强，其次是GQ-10、PL-9和GA-8。在咸味增强方面，GQ-10的咸味增强作用最强，其次是AD-7、GA-8和PL-9，表明4条肽之间存在选择性味觉受体识别。

TI分析显示，肽补充溶液表现出快速上升至峰值强度后逐渐下降的模式。鲜味最大强度（I_MAX）值：对照5.67，AD-7为11.75，PL-9为9.25，GA-8为8.42，GQ-10为10.08。肽还将鲜味持续时间从75秒（对照）延长至100秒（PL-9、GA-8）和110秒（AD-7、GQ-10）。咸味I_MAX值：对照5.75，AD-7为10.08，PL-9为8.17，GA-8为7.75，GQ-10为11.75。肽将咸味持续时间从30秒（对照）延长至45秒（GA-8）、60秒（AD-7、PL-9）和75秒（GQ-10）。

4.6 分子对接

与T1R1/T1R3的对接结果表明，结合强度排序为：AD-7（?8.779 kcal/mol）< GA-8（?8.671 kcal/mol）< PL-9（?8.302 kcal/mol）< GQ-10（?7.858 kcal/mol）。AD-7具有最低的对接能量，表明其与T1R1/T1R3具有更强的结合亲和力和更高的鲜味潜力，与电子舌结果一致。肽与受体的结合主要涉及碳氢键、常规氢键、盐桥、疏水相互作用和静电相互作用，其中氢键为主要作用力。ALA176、ASN150、LYS155、GLN222和LYS5是最频繁出现的相互作用残基。Asp219在AD-7中出现频率最高，该酸性残基已被报道有助于鲜味强度。

与TMC4的对接结果显示，结合能量排序为：GQ-10（?7.681 kcal/mol）< PL-9（?6.863）< AD-7（?6.844）< GA-8（?6.755），与QDA实验中观察到的增咸能力一致。氢键是主要驱动力，占相互作用的60%–78%。GQ-10通过LYS389、GLN383、GLN377、GLU384、ASN221、VAL374和SER214残基与TMC4结合。LYS389的参与在其他3条肽中未观察到，表明这种特定相互作用可能是GQ-10具有优异增咸性能的关键因素。

与TRPV1的对接结果显示，结合能量为?6.85（GQ-10）、?6.566（GA-8）、?6.416（AD-7）和?6.032（PL-9）kcal/mol。氢键和疏水相互作用是与TRPV1结合的主要机制。苦味氨基酸（Leu、Phe、Met）在结合位点（如Leu664、Met547、Leu577）的普遍存在表明，这些残基通过疏水相互作用促进咸味感知，通过最小化肽与受体之间的水接触来稳定复合物。

4.7 分子动力学模拟

100 ns分子动力学模拟结果表明，AD-7与T1R1/T1R3形成最稳定的复合物，具有最低的配体RMSD（约0.15–0.20 nm）和最小的蛋白质扰动（约0.4–0.5 nm）。AD-7和PL-9在整个模拟过程中维持了持续的高氢键数量（约8–14个），有利于增强结合稳定性。AD-7和PL-9的回转半径（Rg）值稳定在约2.95–3.0 nm，表明这些复合物保持了更紧凑的折叠状态。结合自由能计算显示，T1R1-T1R3/AD-7和T1R1-T1R3/PL-9表现出高结合能（?71.19和?73.00 kcal/mol），其次是T1R1-T1R3/GQ-10（?58.04 kcal/mol）。

对于TMC4受体，GA-8和PL-9表现出最低的平均RMSD（约0.15 nm），表明优异的结合稳定性。GQ-10拥有最高的平均氢键数量（约10个），表明广泛的氢键网络增强了结合稳定性。结合自由能值：AD-7为?45.74 kcal/mol，GA-8为?26.50 kcal/mol，GQ-10为?50.23 kcal/mol，PL-9为?42.50 kcal/mol，静电和范德华相互作用是主要贡献者。

对于TRPV1受体，GQ-10表现出最低的RMSD（约0.20–0.30 nm）和最小的波动，表明在结合位点内具有最稳定的构象。GA-8形成最高数量的氢键（约6–12个），具有高持续性。结合自由能值：AD-7为?42.65 kcal/mol，GA-8为?69.85 kcal/mol，GQ-10为?42.98 kcal/mol，PL-9为?18.43 kcal/mol。值得注意的是，TMC4上的结合自由能（范围?26.50至?50.23 kcal/mol）总体上比TRPV1上（范围?18.43至?69.85 kcal/mol）更负，尽管GA-8对TRPV1表现出异常强的亲和力（?69.85 kcal/mol）。

五、讨论与结论

综合分子对接和分子动力学模拟结果，4条肽在TMC4和TRPV1上均能稳定结合，但具有不同的偏好。在TMC4上，PL-9和GA-8表现出最紧凑和稳定的复合物（最低的RMSD、Rg和SASA），而GQ-10通过最丰富的氢键网络增强稳定性，这可能是GQ-10表现出更高咸味增强感知的原因。在TRPV1上，GQ-10表现出最稳定的配体构象，而AD-7和PL-9对整体蛋白质结构造成的扰动最小。结果表明，TMC4可能是大多数测试肽更一致有利的靶点，支持其在低钠食品开发中的相关性。

本研究从山羊乳清中鉴定出4条新型双味肽（GA-8、PL-9、AD-7和GQ-10），其中AD-7表现出最显著的鲜味强度，GQ-10表现出最强的咸味增强作用。分子对接揭示这些肽通过氢键网络与T1R1/T1R3鲜味受体形成稳定复合物，鉴定出ALA176、ASN150、LYS155、GLN222、Asp219和LYS5为关键相互作用位点。酸性氨基酸含量与鲜味强度之间建立了正相关关系。对于咸味感知，分子对接和动力学模拟表明，肽通过静电和氢键相互作用与TMC4结合（GQ-10独特地参与Lys389），通过涉及Leu、Phe和Met的疏水相互作用与TRPV1结合。分子动力学模拟进一步证实，所有4条肽在100 ns轨迹中均与T1R1/T1R3、TMC4和TRPV1保持稳定的结合构象。

本研究存在若干局限性。分子机制主要通过计算机对接和动力学模拟阐明，需要实验验证。此外，ENaC、TMC4和TRPV1对观察到的咸味增强的相对贡献仍有待阐明。未来研究应侧重于使用细胞实验验证这些发现，以阐明通路特异性贡献。解决这些问题将进一步确立乳清来源肽作为有效食盐替代品的潜力。