《Food Research International》：Rational design of hydrophobic deep eutectic solvents tunes the catalytic pocket of lipase for the sustainable synthesis of structural lipids
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•开发了一种环己酮：月桂酸（2:1）深度共熔溶剂（DES），解决了溶剂-酶兼容性悖论，实现了创纪录的MLCT产率88.17%。•建立了一个框架，即通过合理的溶剂设计来调控生物分子机制，作为蛋白质工程的低成本替代方案，证明了非生物介质可以被调控以优化酶的性能。•分子动力学模拟揭
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开发了一种环己酮：月桂酸（2:1）深度共熔溶剂（DES），解决了溶剂-酶兼容性悖论，实现了创纪录的MLCT产率88.17%。
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建立了一个框架，即通过合理的溶剂设计来调控生物分子机制，作为蛋白质工程的低成本替代方案，证明了非生物介质可以被调控以优化酶的性能。
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分子动力学模拟揭示，DES通过维持最优开放构象并防止过度灵活性，稳定了脂肪酶的关键盖子区域。
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DES将催化口袋重塑为最优体积，增强了底物亲和力，将底物牢固锚定在活性位点内，从而驱动优异的催化作用。
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在新DES中，生物催化剂经过五次重复使用后保留了90%以上的活性，表现出优于传统溶剂的稳定性。
引言
脂质是人类营养的基础。然而，现代饮食中长链三酰甘油（LCTs）的过量摄入已成为肥胖、糖尿病和心血管疾病等全球健康危机的关键驱动因素（Cheng等，2024；Lingvay等，2024）。因此，开发新型油脂来替代传统食用油具有重要的健康意义和应用价值。结构化脂质（SLs）是一类通过分子重新设计而创建的功能性油脂。结构化脂质通过对三酰甘油（TAG）分子进行重组而产生。这一过程改变了甘油骨架上脂肪酸的类型、位置或分布。这些结构修饰可以赋予理想的特性，包括改善吸收性、降低热量值和减少饱和脂肪酸含量（Feltes等，2013；Ijaz & Sun，2025）。在这些结构化脂质中，中链和长链三酰甘油（MLCTs）已成为一个颇受关注的研究课题。MLCTs可以同時提供中链脂肪酸（MCFAs）和长链脂肪酸（LCFAs）。它们保留了中链三酰甘油（MCTs）的优点，如易于消化和快速提供能量，同时也通过所含的LCFAs提供必需脂肪酸（Han等，2025；He等，2024；Lee等，2022；More等，2018）。研究表明，MLCTs的高效消化和吸收可以满足婴儿的高能量需求，适应其未成熟的胃肠道，并改善脂质吸收（Chen等，2025；Q. Liu等，2023；Nejrup等，2017）。例如，Yuan等开发了一种酶法合成母乳脂肪替代物的方法，使用混合油和月桂酸作为底物。在优化条件下（月桂酸与油比为3:1，50°C，8% Lipozyme RM IM，反应3小时），MLCTs的产率达到80.98%（Yuan等，2025）。因此，MLCTs在婴儿配方食品中具有广阔的应用前景。不幸的是，MLCTs在天然油脂中含量有限，浓度较低，无法满足大规模应用的需求。因此，必须通过人工合成来实现高效生产。
酶法合成已被广泛应用于食品工业中以生产各种改性脂质（Li等，2021；Zou等，2024）。在100 bar、50°C、300 rpm、摩尔比4:1的条件下，以Novozym 435为催化剂，反应时间为5小时，More等仅实现了63.2%的MLCTs产率（More等，2018）。Liu等报道了在40°C下，使用Novozym 40,086（相对于MCTs为7 wt%）作为催化剂，MLCTs转化率为75.4%（J. Liu等，2024）。Yang等进行了椰油与LCTs之间的酯交换反应，由自研的固定化酶CSL@HMS-C8催化，实现了78.7%至83.8%的MLCTs产率（C. Yang等，2025）。上述研究聚焦于压力、温度和生物催化剂等参数，获得了较高的MLCTs产率，为推动酶法生产MLCTs提供了坚实的技术支持。溶剂可以通过多种机制影响酶促反应效率。它们可能改变酶的构象动力学（Mieres-Perez等，2025；Mohtashami等，2019）或竞争性干扰底物结合（Buarque等，2025；Mil?i?等，2022；Rajakumara等，2022）。溶剂还可能影响反应中间体的构象（Jurich等，2025）并改变底物的反应活性（Potts等，2021；Zhou等，2025）。因此，溶剂工程被认为是提高酶促反应效率最有效的途径之一。例如，Radhakrishnan等在300 K下通过500 ns分子动力学模拟，比较了漆酶在水和含有30%丙酮或30%乙腈的混合溶剂中的行为。他们的模拟表明，这两种溶剂对漆酶的构象动力学和活性的影响不同。丙酮保留了更大的构象自由度，被认为有利于催化。相比之下，乙腈与酶形成更强的相互作用并限制其分子运动，从而降低了催化活性（Radhakrishnan等，2022）。
深度共熔溶剂（DESs）作为一类新型环保溶剂，是传统有机溶剂的理想替代品（Cunha & Fernandes，2018；El Achkar等，2021；Tang等，2015）。早期研究主要评估了其可行性，并证明深度共熔溶剂的组成会影响底物溶解度、水活度、酶活性和竞争反应。例如，Durand等评估了各种深度共熔溶剂在CALB催化的醇解反应中的应用，发现某些氢键供体组分可能参与副反应。后续研究将DES辅助生物催化扩展到疏水体系（Durand等，2012）。Hollenbach等提出了一种由薄荷醇和癸酸组成的疏水DES，作为亲水性DES的替代品用于糖脂的酶法合成。通过将葡萄糖浓度提高到1.5 M，24小时后葡萄糖单癸酸酯的产率显著提高到164.27 ± 9.98 μmol/g（Hollenbach等，2020）。我们的研究小组此前开发了一系列DES溶剂系统，用于酶法合成氨基酸酯（Nian等，2020）、维生素E琥珀酸酯（Ma等，2024）和葡萄糖酯（Qi等，2024），均采用了计算机辅助溶剂设计策略，并实现了高产率。分子动力学模拟的结果也揭示，强极性有机溶剂（如DMSO）会导致脂肪酶活性口袋尺寸增大，不利于底物锚定，从而限制了反应速率（Ma等，2024）。相比之下，疏水性DES，如环己酮：月桂酸（2:1）体系（2Ch-La），能更好地维持酶底物结合口袋的尺寸。这有利于底物分子的锚定以及适合反应的过渡态结构的形成。在该体系中，葡萄糖酯的产率达到了98.85%（Qi等，2024）。这表明溶剂可以通过调节酶底物结合口袋的尺寸来影响酶促反应效率，从而影响其锚定底物的能力。基于此机制，我们的先前工作系统探索了亲水性DES在合成大分子MLCTs中的应用。结果表明，在氯化胆碱：甘油（1:1）体系中获得了最高的MLCTs产率71.11 ± 0.82%。进一步的马尔可夫态模型分析表明，脂肪酶能够在氯化胆碱：甘油（1:1）体系中有效维持底物结合口袋的动态构象平衡，从而产生优异的催化性能（Han等，2025）。为进一步探讨疏水性DES是否能为大分子三酰甘油底物的酯化反应建立有利的催化口袋微环境，本研究首先实验筛选了一系列疏水深度共熔溶剂作为MLCTs合成的反应介质。本研究的目的是通过先进的溶剂设计策略提高MLCTs产率，并为MLCTs酶法合成工艺的改进做出贡献。
章节摘要
试剂与酶
Novozym 435（9000 PLU/g）购自诺维信（中国）生物科技有限公司。Candida sp. 99-125脂肪酶（CSL，193 U/g）由北京化工大学提供。Amano脂肪酶（AML，579 U/g）、Candida rugosa脂肪酶（CRL，520 U/g）、猪胰脂肪酶（PPL，429 U/g）、Rhizomucor javanicus脂肪酶（RJL，498 U/g）、牛胰脂肪酶（BPL，69 U/g）、Rhizopus niveus脂肪酶（RNL，237 U/g）和细菌纤维素酶脂肪酶（BCL，700 U/g）购自
酶与底物之间共振溶剂的筛选
在越来越强调绿色化学和可持续生产的背景下，旨在开发一种高效、低成本、可持续的MLCTs酶法合成工艺，本研究首先关注反应介质的选择。筛选了44种疏水DES和有机溶剂（表1，图S2）。结果表明，不同溶剂体系之间的MLCTs产率存在显著差异，充分证明了反应介质的关键调控作用
结论
MLCTs是一类通过分子设计生产的功能性结构化脂质，具有促进脂质消化吸收和减少脂肪积累等生理特性。它们在食品、营养和制药等领域展现出广阔的应用前景。然而，目前MLCTs的天然来源有限，且化学或酶法合成的产率普遍较低，这严重限制了大规模生产和实际应用
CRediT作者贡献声明
韩一冉：初稿撰写、可视化、验证、方法学、调查。陈志恒：初稿撰写、调查。方浩：调查。胡毅：经费获取。年彬彬：审稿与编辑、监督、经费获取、概念化。
关于生成式AI及AI辅助技术在写作过程中的声明
在撰写本文的过程中，作者使用了AI辅助写作工具来支持语言编辑、结构修订和清晰度检查。作者在使用这些工具后对内容进行了审阅和编辑，并对本文的内容承担全部责任。
利益冲突声明
作者声明不存在任何可能影响本文所报告工作的已知竞争性财务利益或个人关系。
致谢
本研究得到了国家自然科学基金（No. 32402026）和江苏省高校自然科学基金（24KJB530015）的资助。
韩一冉|陈志恒|方浩|胡毅|年彬彬
