《Future Foods》：Sequence-resolved discovery and cellular validation of immunomodulatory peptides from cricket protein hydrolysate
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蟋蟀蛋白水解物（CPH）是一种有前景的替代蛋白衍生原料，但其活性肽序列及其潜在生物活性背后的机制仍难以阐明。本研究采用整合策略，结合细胞实验、转录组学、基于液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）的从头肽组学、基于结构的筛选以及肽段验证，在脂多糖（LPS）刺
蟋蟀蛋白水解物（CPH）是一种有前景的替代蛋白衍生原料，但其活性肽序列及其潜在生物活性背后的机制仍难以阐明。本研究采用整合策略，结合细胞实验、转录组学、基于液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）的从头肽组学、基于结构的筛选以及肽段验证，在脂多糖（LPS）刺激的BV2小胶质细胞中评估了CPH的活性。CPH减弱了LPS诱导的炎症激活，表现为促炎细胞因子产生、一氧化氮释放和活性氧（ROS）累积减少。转录组学分析显示，CPH广泛调节炎症相关通路，包括肿瘤坏死因子（TNF）、Toll样受体、NOD样受体、白细胞介素-17（IL-17）和JAK-STAT信号通路。随后，JAK-STAT信号通路被选作具有生物学相关性的细胞因子响应通路进行深入研究，而非作为主要的转录组响应。从头肽组学分析显示，CPH主要含有短肽，这些短肽随后经过肽段表征、生物信息学过滤、基于结构的优先级排序、分子动力学模拟和细胞验证。数个CPH衍生肽段显示出与STAT3 SH2结构域的预测兼容性。经筛选的肽段降低了LPS诱导的白细胞介素-6（IL-6）和TNF-α分泌，而它们对氧化应激、IBA1表达和STAT3磷酸化的影响因肽段序列而异。CPH还降低了LPS诱导的STAT3磷酸化，为水解物水平与肽段水平的研究结果提供了关联。综上所述，这些结果表明，经筛选的CPH衍生肽段可能调节与STAT3相关的炎症信号。本研究建立了一种序列解析的工作流程，用于从蟋蟀蛋白水解物中鉴定免疫调节肽，并支持CPH作为具有细胞抗炎活性的候选功能性肽的来源。
### 论文解读
**研究背景与现存问题**
脑部炎症是神经功能障碍和神经退行性疾病进展的重要驱动因素。小胶质细胞作为中枢神经系统的常驻免疫细胞，在免疫监视和组织稳态中发挥关键作用，但持续过度激活会驱动促炎细胞因子和活性氧的过量产生，加剧神经元损伤。这些反应受多种胞内信号网络调控，其中JAK-STAT通路居于核心地位，STAT3作为该通路的关键节点，其持续激活与脑部炎症和神经退行性疾病相关。食品源生物活性肽因其免疫调节和脑保护潜力日益受到关注，然而，食品蛋白水解物成分复杂，其生物活性多在混合物层面报道，具体活性肽序列、生化特征及通路层面的作用机制往往难以解析，这限制了构效关系的理解和功能性食品配料的开发。蟋蟀蛋白作为新兴的可持续高营养替代蛋白源，其水解物具有潜在生物活性，但CPH对小胶质细胞炎症激活的调节作用及其中的功能性肽成分尚未被系统研究。因此，迫切需要从复杂的水解物中鉴定出明确的生物活性肽序列。
**研究内容与总体结论**
研究人员在LPS刺激的BV2小胶质细胞模型中评估了CPH的抗炎效应，并整合转录组学、基于LC-MS/MS的从头肽组学、生物信息学过滤、基于结构的虚拟筛选、分子动力学模拟以及细胞验证，将CPH的细胞效应与特定的肽序列联系起来。研究结果表明，CPH能减弱LPS诱导的小胶质细胞炎症激活和氧化应激，并鉴定出数个具有抗炎活性的CPH衍生肽段，这些肽段可调节STAT3相关的炎症信号。该研究建立了一种从水解物到功能肽序列的解析工作流程，支持蟋蟀蛋白作为功能性肽来源的开发潜力。
**关键技术与方法**
研究人员使用了以下关键技术方法：1）体外细胞炎症模型：采用LPS刺激的小鼠小胶质细胞系BV2（来源于Prof. Anna Barron实验室），以评估CPH及候选肽段的抗炎活性；2）转录组学分析：对处理组细胞进行RNA测序（RNA-seq），结合差异表达基因（DEG）分析、GO/KEGG富集分析、基因集富集分析（GSEA）及蛋白-蛋白相互作用（PPI）网络分析；3）从头肽组学：采用LC-MS/MS对CPH进行从头测序，并通过PEAKS软件解析肽段序列；4）结构导向筛选：整合PeptideRanker和CPPpred生物信息学过滤，利用Schr?dinger Suite进行分子对接，并通过GROMACS进行分子动力学（MD）模拟，评估候选肽与STAT3 SH2结构域的结合模式；5）细胞功能性验证：采用ELISA、Western blot和免疫荧光等技术验证肽段活性。CPH原料来源于Acheta domesticus蟋蟀粉（Global Bugs Ltd., 泰国）。
**研究结果**
* **CPH减弱LPS诱导的BV2小胶质细胞炎症**：通过CCK-8、RT-qPCR、ELISA、Griess法和DCFH-DA荧光探针等实验，研究人员发现CPH在250 μg/mL浓度以内无细胞毒性，并可明显抑制LPS诱导的促炎细胞因子（Il1b、Il6、Tnf）mRNA表达和IL-1β、IL-6、TNF-α蛋白分泌，同时降低一氧化氮（NO）释放和细胞内活性氧（ROS）累积。这表明CPH能有效缓解小胶质细胞的炎症反应和氧化应激。
* **转录组学分析鉴定JAK-STAT信号通路**：RNA-seq分析显示，CPH处理逆转了部分LPS诱导的基因表达变化。KEGG富集分析表明，受CPH影响的基因富集于TNF、Toll样受体、NOD样受体、IL-17和JAK-STAT等炎症相关通路。鉴于JAK-STAT通路与细胞因子信号和微胶质细胞炎症的密切关联，且其相关基因（如Jak2、Stat1、Stat2、Stat3）的表达被LPS上调并被CPH部分恢复，研究人员选择STAT3作为后续基于结构的肽段优先级排序的候选信号节点。
* **肽组学特征与结构导向筛选**：从头肽组学分析鉴定出25,582条CPH衍生肽，其中大部分为分子量小于1 kDa的短肽（5-8个氨基酸为主），富含疏水性残基。经生物信息学过滤、分子对接和分子动力学模拟，APRPVPPR (APR)、APLAAPLAR (APL)、WKLW (WKL) 和PQDLLLR (PQD) 因与STAT3 SH2结构域表现出较好的预测结合亲和力及相对稳定的动态行为而被优先选出。
* **经筛选肽段的抗炎作用**：在LPS刺激的BV2细胞中，APR、APL、WKL和PQD均能显著减少TNF-α和IL-6的分泌。在等摩尔浓度比较中，APR展现出最持续和最强的抑制效果。此外，APR、APL和PQD可减少细胞内ROS积累，但WKL无显著影响。序列特异性实验表明，APR的抗炎活性具有序列依赖性，因为组成匹配的 scrambled 肽（RPPVAPPR）无显著效应。
* **CPH及筛查肽段对STAT3相关信号的调控**：Western blot结果显示，CPH能显著抑制LPS诱导的STAT3在Tyr705位点的磷酸化。在候选肽中，APR、APL、PQD和WKL同样降低了LPS诱导的p-STAT3水平。免疫荧光分析进一步表明，APR、WKL和PQD可显著降低LPS诱导的IBA1荧光强度（小胶质细胞激活标志），而APL作用不显著。这提示不同肽段对小胶质细胞炎症的不同方面调节作用有所差异。
**讨论与结论**
讨论部分指出，本研究通过将水解物水平的细胞效应与转录组通路变化及序列解析的肽段联系起来，为评估替代蛋白水解物提供了重要策略。CPH的广谱抗炎作用提示其对微胶质细胞激活网络具有整体抑制效应。STAT3被选作研究切入点，而非定义为唯一靶点。肽段活性差异可能与稳定性、摄取、溶解性及细胞内可用性等因素有关，BV2细胞模型存在局限性，未来需在原发性微胶质细胞、体内模型及食物基质环境中进一步验证。研究结论指出，CPH衍生肽可减少微胶质细胞炎症反应，本研究鉴定了数个具有可测量抗炎活性的特定序列，所建立的整合方法学为从复杂水解物中发现功能肽候选物提供了实用路径，支持蟋蟀蛋白作为功能肽来源的潜在价值。
