水凝胶超微结构分析中的微孔困境：样品制备方法对pNIPAM水凝胶孔隙结构表征的影响

《Giant》：The micropore conundrum – examining the preparation of hydrogels for ultrastructural analysis

　　

水凝胶孔尺寸表征的常用技术是对冻干（即冷冻干燥）凝胶进行扫描电子显微镜（SEM）分析。典型的样品制备涉及冷冻步骤：从将块体样品浸入液氮中的所谓快速冷冻，到例如在?80 °C冰箱中过夜的慢速冷冻，方法各异。水的相图解释了为何必须对此进行批判性审视。由于水具有优异的物理化学性质组合——如其热容、热导率以及冰晶形成过程中的自由能变化——慢速冷冻会导致冰晶形成和相分离。对于生物材料而言，已有研究表明只有超快速冷冻（毫秒级）才能保留大分子、细胞和组织的天然状态。在该范式下，将形成玻璃态水，即一种无定形、非晶态的固体。为研究块状标本（如组织块），有必要发展高压冷冻（HPF）技术，即在极高压（>2000 bar）下于毫秒内将样品玻璃化。该方法的缺点是尺寸限制——只有厚度不超过200 μm的极薄材料片才能完全玻璃化。据研究人员所知，经HPF处理的藻酸盐（alginate）水凝胶中多糖链的首批图像是在冷冻替代和超薄切片后通过透射电子显微镜（TEM）拍摄的。在最近一项评估不同冷冻制度对藻酸盐（alginate）水凝胶超微结构影响的冷冻扫描电子显微镜（cryo-SEM）研究中，明确证明只有HPF才能提供均匀玻璃化的样品，而浸入液氮浆或液态乙烷中的 plunge freezing 总是在样品外围产生较小孔洞，在样品中心产生较大孔洞。由于HPF和cryo-SEM仍未被广泛使用，且可处理的样品体积相当有限，研究人员寻找一种更易实现的方法来保存和可视化水凝胶结构以进行超微结构研究。电子显微镜（EM）成像的一个先决条件是用重金属对样品进行染色，重金属将与电子束相互作用从而产生对比度。在生物样品中，这通常用四氧化锇（OsO4）完成，其可与C=C双键结合，从而主要染色和稳定脂质膜。由于研究人员的示例水凝胶pNIPAM不含此类双键，研究人员使用单宁酸（TA），这是一种多酚类化合物，长期以来在生物电子显微镜中用作重金属的媒染剂。TA具有许多可用的羟基，可通过氢键与大量生物聚合物相互作用，并介导OsO4的结合。其作为“支化星形多邻苯二酚”的化学性质也使TA对材料科学具有吸引力：它已被用作超分子水凝胶中的粘合剂，并与聚乙烯醇（PVA）结合用于制造形状记忆水凝胶。在本研究中，研究人员首先证明，对高含水量的大块pNIPAM水凝胶进行常规冷冻会导致微孔形成。基于TA渗透水凝胶的新方法可防止这种情况。研究人员在块体材料的断裂面和通过超薄切片从树脂包埋水凝胶获得的切片中检测到纳米孔。为将研究人员的方案扩展到当前增材制造（特别是双光子直写（DLW））的关注点，研究人员研究了基于pNIPAM的光刻胶如何受益于TA预处理。通过这种新颖且易于遵循的方案，双光子聚合（2PP）的pNIPAM微柱得以保存用于直接SEM成像，从而可快速筛选和评估新墨水或新材料组成。

水凝胶超微结构分析中的微孔困境：样品制备方法对pNIPAM水凝胶孔隙结构表征的影响

一、研究背景与目的

水凝胶孔尺寸表征的常用技术是对冻干凝胶进行扫描电子显微镜（SEM）分析，而典型的样品制备涉及冷冻步骤。然而，由于水的独特物理化学性质，慢速冷冻会导致冰晶形成和相分离，从而在水凝胶中引入微米级的孔洞伪影，这些伪影并不能反映水凝胶的天然结构。对于生物材料，只有超快速冷冻（毫秒级）才能保留大分子、细胞和组织的天然状态，而高压冷冻（HPF）虽可实现玻璃化，但受限于样品尺寸（仅约200 μm厚的薄片）。由于HPF和冷冻扫描电子显微镜（cryo-SEM）尚未广泛普及且可处理样品体积有限，研究人员旨在寻找一种更易实现的方法来保存和可视化水凝胶结构以进行超微结构研究。本研究以聚N-异丙基丙烯酰胺（pNIPAM）水凝胶为模型材料，系统评估了不同样品制备方法对孔隙结构表征的影响，并提出一种基于单宁酸（TA）预处理的新方案，以避免冷冻过程中微孔伪影的形成，实现接近天然状态的水凝胶超微结构观察。

二、研究内容与主要结论

研究人员采用两种不同配方的pNIPAM水凝胶：自由基聚合制备的pNIPAM(radPol)（含水量约92%，交联度低）和光聚合制备的pNIPAM(photoPol)（含水量约68%，交联度高，适用于双光子直写（DLW））。研究发现，直接冷冻干燥pNIPAM(radPol)水凝胶会引入200–500 μm、20–100 μm和1–5 μm等多层次微孔，这些孔洞由冰晶形成导致的相分离所产生，属于制备伪影。经TA和四氧化锇（OsO₄）预处理后再冻干，样品不再出现微孔，而在高倍率下可观察到20–100 nm的纳米孔。通过树脂包埋和超薄切片完全避免冷冻过程，同样可观察到约49 nm的纳米孔网络，证实TA处理确实能防止微孔形成。对于pNIPAM(photoPol)水凝胶，直接冻干会导致表面至中心呈层级分布的冰晶孔洞，而TA/OsO₄预处理后冻干仍会出现长裂纹，但基质断裂面可观察到典型的纳米孔结构。将TA/OsO₄预处理方案应用于双光子聚合（2PP）打印的pNIPAM微柱阵列，经冻干、风干或树脂包埋切片后均可在SEM下清晰观察其形貌和内部纳米孔网络。该研究的重要意义在于提出了一种简便、常规的水凝胶电镜样品制备方案，可有效避免因冷冻不当导致的微孔伪影，为水凝胶超微结构研究提供了接近天然状态的观察途径，并适用于多种水凝胶体系。

三、关键技术与方法

本研究主要采用了以下关键技术方法：自由基聚合和光聚合制备两种不同配方的pNIPAM水凝胶；双光子直写（DLW）技术制备pNIPAM微柱阵列；单宁酸（TA）渗透预处理结合四氧化锇（OsO₄）染色以稳定水凝胶结构并提供电镜对比度；冷冻干燥（冻干）与树脂包埋超薄切片两种样品制备路径的对比；扫描电子显微镜（SEM）成像，包括二次电子（SE）和能量选择背散射（ESB）探测器；基于Fiji软件和Feret直径的孔尺寸统计分析。样品来源为实验室自制的pNIPAM水凝胶，无临床样本队列。

四、研究结果

4.1 微孔与纳米孔：pNIPAM(radPol)水凝胶中的孔隙伪影辨析

研究人员首先将pNIPAM(radPol)水凝胶在?80 °C冷冻后冻干，发现原本透明的材料变为白色且皱缩，SEM观察显示存在200–500 μm的大孔、20–100 μm的孔域以及1–5 μm的更小孔洞，基质区域几乎无结构细节。经TA和OsO₄预处理后冻干的样品保持光滑表面，无微孔出现，高倍率下可观察到脊状结构并可分辨为纳米级孔洞。孔尺寸统计分析显示，直接冻干样品的平均孔径（Feret最小直径）中位数约为2 μm（n=1561个孔），而TA/OsO₄处理后冻干样品的平均孔径中位数约为25 nm（n=1326个孔）。为避免冷冻过程，研究人员将TA/OsO₄预处理后的样品经丙酮脱水和环氧树脂包埋后进行超薄切片，SEM观察显示均匀的纳米孔网络（20–100 nm），统计分析平均孔径为49 nm（n=43,294个孔），与冻干断裂面观察到的纳米孔尺寸范围一致。

4.2 光聚合pNIPAM宏观柱与微柱的基准测试

研究人员对适用于双光子聚合（2PP）的pNIPAM(photoPol)配方进行了评估。直接冻干后，该水凝胶变为不透明，断裂面呈现表面小孔向中心大孔递变的层级分布，表明冰晶尺寸受冷却速率空间梯度控制。经TA和OsO₄预处理后冻干，样品出现表面下的细长裂纹，可观察到空气-水凝胶界面形成的致密“皮层”结构，但真正断裂的基质区域仍显示典型的纳米孔结构。研究人员将TA/OsO₄预处理方案应用于2PP打印的pNIPAM微柱阵列（直径20 μm，高度40 μm），分别经冻干、风干和树脂包埋切片处理后进行SEM观察。风干样品表面呈现规则的纳米孔网络，冻干样品表面呈不规则网络并伴有近1 μm的杯状凹陷，包埋切片样品中可区分高电子密度的外层和低电子密度的中心区域，高倍率下两层均呈现与纳米孔对应的特征网络图案。

五、讨论与结论

讨论部分总结：慢速冷冻过程中冰晶形成和相分离是微孔伪影产生的根本原因，其影响程度取决于水凝胶的含水量和交联度。高含水量、低交联度的pNIPAM(radPol)对冷冻伪影更为敏感，而高交联度的pNIPAM(photoPol)中冰晶尺寸呈空间有序分布。TA通过其大量羟基与水分子强烈配位，有效减少可自由扩散用于结晶的水分子数量，增加水粘度，从而抑制冰晶生长，即使在中低冷却速率下也能防止微孔形成。树脂包埋和超薄切片可完全避免冷冻过程，适用于观察水凝胶内部结构。对于2PP打印的微结构，TA处理结合OsO₄染色和风干是一种快速可靠的SEM样品制备方案，适用于墨水配方筛选和打印参数优化。该方案经初步验证也适用于聚丙烯酰胺（PAM）、明胶甲基丙烯酰（GelMA）、聚乙二醇二丙烯酸酯（PegDA）和果胶多糖等多种水凝胶体系。

研究结论：目前尚不存在一种简单、常规且完全无伪影或能完美保存水凝胶天然状态的电镜样品制备方案。冷冻电镜（cryo-EM）作为金标准方法受限于样品尺寸。本研究旨在揭示水凝胶孔隙表征多样性的原因，并提出一种非冷冻电镜样品制备方案，尽可能模拟天然含水体系。研究人员不声称完全保留了水凝胶的天然溶胀状态，而是提出一种化学稳定化方法，可最大限度减少因冷冻不当导致的微孔形成，为研究接近天然状态的结构提供可靠便捷的途径。单宁酸（TA）凭借其大量羟基，可有效替代水分子并限制水分子的结晶能力，是促进水凝胶电镜样品简便常规制备、避免微孔伪影形成的理想添加剂。