gavage-fomite（GaF）法：一种低死亡率且免疫成熟的自然微生物群小鼠模型生成方法

《The Journal of Immunology》：A gavage-fomite based method to generate mouse models with natural microbiota

　　

实验室饲养的无特定病原体（specific pathogen-free, SPF）小鼠对于基础免疫学研究不可或缺，但它们在预测人类临床结局方面的可靠性一直受到质疑。导致这种脱节的一个主要因素是过度清洁的饲养环境，使实验室小鼠无法获得对免疫成熟至关重要的生理性微生物暴露。目前已开发出多种方法将微生物引入SPF小鼠，旨在模拟类似人类的微生物经历，并产生成人样免疫特征。然而，其中一些方法，特别是宠物店小鼠共饲养法，存在由不受控制的微生物交换导致的病原体暴露显著变异，并且与较高的死亡率相关。在此，研究人员提出了一种替代的管饲-污染物（gavage-fomite, GaF）方法，该方法使小鼠暴露于与宠物店小鼠共饲养法相似多样的病原体和共生菌群，同时限制死亡率。GaF处理的小鼠表现出均一的肠道微生物组成、以黏膜T细胞分布为特征的强健免疫成熟、升高的血清炎症细胞因子，以及与成人高度一致的脾脏免疫转录特征。此外，这些小鼠在对强毒细菌的攻击中表现出增强的保护力。GaF方法生成“具有自然微生物群的小鼠”的简单性和有效性，可能支持这些模型在基础与转化免疫学研究中的更广泛应用。

**论文解读：GaF法生成自然微生物群小鼠模型**

**研究背景与目的**
实验室饲养的无特定病原体（SPF）小鼠虽为免疫学研究基石，却因缺乏自然微生物暴露而难以准确预测人类临床结局。人类长期与病原体、共生菌及环境因素相互作用，其免疫系统成熟度远超超清洁实验室小鼠。为模拟人类微生物经历，领域内已开发出多种“自然微生物群小鼠”（MNM）模型，如野化、野生化、sequential exposure及宠物店共饲养法等。然而，这些方法存在显著局限：野化/野生化需特殊设施和技术，宠物店共饲养法虽能产生成人样免疫特征，但微生物交换不可控导致个体/笼间变异大，且实验室小鼠死亡率高达10%~100%。因此，研究者急需一种既保留广谱微生物暴露和免疫成熟效果，又能降低变异性和死亡率的可控方法。

**研究内容与结论**
研究人员基于共饲养中粪-口传播的主要途径，开发了管饲-污染物（gavage-fomite, GaF）法：将宠物店小鼠盲肠内容物（>30只混合）经口管饲SPF C57BL/6小鼠，并每周两次转移污染垫料（fomite）以提供持续非肠道微生物暴露，整个处理周期至少60天。结果显示，GaF组存活率显著高于共饲养组（>95% vs 40天内死亡超50%），且获得了与共饲养组相似的广谱病原体暴露谱，包括病毒、螨虫和蛲虫。GaF处理的小鼠肠道菌群组成更均一、无笼间隔离，外周血中抗原经历型CD8⁺ T细胞、记忆B细胞及炎症细胞因子（IFN-γ、CXCL10等）水平升高，脾脏转录组富集成人和共饲养小鼠特征，尤其是I型干扰素相关基因。在致死性单核细胞增生李斯特菌（*Listeria monocytogenes*）攻击中，GaF小鼠全部存活，肝脏细菌载量显著低于SPF小鼠。该方法简单、可重复，有望推动MNM模型在基础和转化免疫研究中的跨机构应用。

**关键技术方法**
本研究的样本队列包括购自Jackson Laboratory的SPF C57BL/6小鼠和购自Rhode Island地区宠物店的宠物店小鼠。主要技术包括：①收集宠物店小鼠盲肠内容物制备甘油菌液，对SPF小鼠口服管饲100 μL，并每周两次转移约12 g脏垫料作为持续暴露；②通过多重荧光免疫分析（MFIA）血清学检测和PCR法评估病毒、细菌及寄生虫暴露；③对粪便样本进行16S rRNA基因（V4/V5区）测序，使用QIIME2/DADA2流程分析菌群多样性及组成；④采用光谱流式细胞术和t-SNE降维分析外周血及黏膜组织免疫细胞；⑤对脾脏进行RNA-seq，并与公共数据集（GSE27272、GSE78979）进行基因集富集分析（GSEA）；⑥通过静脉感染*L. monocytogenes*评价抗感染保护力。

**研究结果**
**1. GaF方法引入广谱病原体暴露并限制死亡率**
通过血清学和PRIA检测发现，GaF组对多种单链DNA病毒（如小鼠细小病毒）、蛲虫和螨虫呈阳性，而仅管饲组对某些非肠道微生物阴性；共饲养组却高比例获得支原体（*Mycoplasma pulmonis*）感染。存活率统计显示，GaF组120天观察期存活率>95%，共饲养组40天内死亡超50%，仅管饲组亦有约18%死亡。

**2. GaF方法诱导更均匀的肠道菌群变化**
16S rRNA基因测序显示，GaF和仅管饲组组内加权UniFrac距离显著低于宠物店和共饲养组，表明细菌组成更一致。主坐标分析（PCoA）显示共饲养组样本按笼聚集，而GaF组无笼间隔离。属水平组成上，GaF和共饲养组与宠物店小鼠相似，且GaF组菌群变化在2周内建立并稳定至少3个月。

**3. 免疫表型分析显示GaF小鼠效应T细胞和细胞因子升高**
流式细胞术检测到所有MNM组外周血中CD44^hi CD8⁺ T细胞和KLRG1⁺ CD8⁺ T细胞