脉冲电场和高强度超声对未完全复溶胶束酪蛋白浓缩物悬浮液分散性、结构及加工性能的影响

《Innovative Food Science & Emerging Technologies》：Effect of pulsed electric field and high-intensity ultrasound on the dispersion, structure and processability of incompletely reconstituted micellar casein concentrate suspensions

　　

摘要：高蛋白微胶乳酪蛋白浓缩物（MCC）粉末具有复水速度慢和悬浮液粘度高的问题，限制了其工业应用。通常建议采用额外的处理方法来辅助这一再水化过程。然而，这些处理方法对酪蛋白浓缩物结构和工艺性能的影响尚知之甚少。本研究评估了高强度超声（US）和脉冲电场（PEF）作为物理处理方法，应用于MCC粉末再水化的早期阶段，使用5%（w/w）悬浮液，并在严格的热控制条件下进行（US：5–20分钟，550瓦，20千赫兹；23–32°C；PEF：16.7–26.7千伏/厘米，5微秒，20赫兹；23–29°C）。超声处理的效果与机械破坏水化不良的粉末衍生聚集体一致，表现为沉淀减少和表观粘度从3.85降至2.10毫帕·秒（p < 0.05）。与此同时，zeta电位增加到-26.3毫伏，表面疏水性升高，而可溶性钙保持不变（41–42毫克/升）。相比之下，脉冲电场产生的表观粘度降低更为温和，数值范围为2.20至2.52毫帕·秒，并使可溶性钙增加到>47毫克/升，表明矿物平衡发生了偏移。对冻干样品进行差示扫描量热分析显示热参数存在处理依赖性变化，而傅里叶变换红外光谱表明二级结构在很大程度上得以保留。对于两种处理，傅里叶变换红外光谱均显示二级结构基本保留，表明主要效应发生在胶体或超分子水平，而非通过可检测的二级结构重排。总体而言，超声和脉冲电场通过不同的工艺依赖性机制修改了与MCC可加工性相关的关键理化指标，超声主要与粗颗粒可沉降部分的破坏有关，而脉冲电场与可溶性钙和胶体性质的变化有关，这表明它们具有针对性应用以改善再水化行为的潜力。

引言：微胶乳酪蛋白是牛乳中最重要的胶体蛋白质系统，约占其总蛋白含量的80%（Onwulata等，2011；Raikos，2010；Walstra & Jennes，1984）。这些蛋白质被组织成由αs1-、αs2-、β-和κ-酪蛋白组成的微胶乳（De Kruif & Holt，2003；Wusigale等，2020），通过胶体磷酸钙（CCP）桥和疏水相互作用稳定。微胶乳表现出开放、多孔的架构，具有高水化率（约3.5毫升水/克蛋白质），并具有对环境条件响应的动态超分子组织（Holt等，2013；Huppertz等，2017）。这种超分子组织赋予了牛奶在正常储存条件下的理化稳定性（Holt等，2013）。重要的是，这种相同的结构排列使酪蛋白微胶乳能够承受膜过滤、浓缩和雾化过程，从而生产出保留天然功能性的微胶乳酪蛋白浓缩物（MCC）和分离物（MCI），作为食品应用中的高价值蛋白质粉原料（Corredig等，2019）。

近年来，对具有特定功能特性的高质量乳蛋白和配料的需求日益增加。工业界对微胶乳酪蛋白的兴趣也随之增长。Future Market Insights（2025）预计2025年全球市场价值约为6.074亿美元，到2035年将增长至10.365亿美元，这意味着复合年增长率为5.5%。这一增长源于健康和健身需求的推动。这些产品的蛋白质含量超过10%（w/w），具有功能和营养方面的优势，但也带来了显著的技术、流变学和复水挑战（Abdallah等，2022；Sauer等，2012），增加了能源成本和加工复杂性（Fournaise等，2021；Gaiani等，2006）。

在原乳中，约70%的总钙位于酪蛋白微胶乳内部，主要与CCP相关，在其中充当离子桥和矿物缓冲剂（Corredig等，2019；Davies & White，1960）。然而，这种矿物分配已知会因膜过滤、喷雾干燥以及随后的粉末再水化而发生改变（Chandrapala等，2014；Schokker等，2011）。正如Holt等（2013）所强调的，微胶乳的稳定性主要由CCP矿物相与κ-酪蛋白表面层之间的平衡所决定。在高蛋白浓度下，拥挤增加了微胶乳间的相遇频率；在降低的pH条件下，κ-酪蛋白层作为空间位阻屏障的效果减弱；而长时间加热可进一步加剧这些效应（Abdallah等，2022；Beliciu等，2012；Crowley等，2015；Sauer等，2012）。综合来看，这些条件可能有利于钙介导的桥联和微胶乳间交联。

为了克服微胶乳酪蛋白粉末在高蛋白饮料中的实际限制，尤其是复水速度慢以及在8%（w/w）以上时表观粘度急剧上升的问题，人们越来越多地考虑在初步再水化后施加物理处理。在此背景下，超声和脉冲电场已被报道为改善酪蛋白微胶乳再水化后分散性、降低粘度和增强水化的有前景的方法（Hemar等，2020；Morais等，2023；Raghunath等，2024；Taha等，2023）。

高强度超声是一种非热技术，已被证明可以改变再水化微胶乳酪蛋白体系的功能性，尤其适用于浓缩配方。例如，Wu等（2020）报道约20千赫兹的低频超声在再水化微胶乳酪蛋白粉末分散液中产生声致空化，与微湍流、局部压力和温度梯度以及强剪切场相关。这些效应被认为可以在不损害蛋白质完整性的情况下改变超分子组装体。该机制可能有助于破坏不溶性粉末聚集体，这些聚集体由蛋白质聚集体（例如喷雾干燥和储存过程中形成交联或融合的酪蛋白微胶乳）结合而成，从而可能改善整体分散性和再水化。重要的是，Schulnies等（2023）观察到，当对20%（w/w）浓度的再水化MCC粉末悬浮液进行超声处理时，粘度降低了多达50%，而对新鲜膜过滤的液态MCC进行超声处理时未检测到粘度变化。这一比较支持了超声主要针对未溶解聚集体而非完整酪蛋白微胶乳的解释。类似地，Zhang等（2018）报道在5%（w/v）浓度下对再水化MCC进行超声处理改变了微胶乳表面形态和二级结构，α-螺旋含量降低，β-折叠信号增加，并伴随溶解度提高。

脉冲电场也被探索为调节再水化酪蛋白体系理化性质和结构特性的非侵入性途径。Taha等（2023）对1%（w/v）的再水化微胶乳酪蛋白悬浮液（在磷酸盐缓冲液中过夜水化后）施加了480纳秒的指数衰减脉冲，电场强度为10–30千伏/厘米，报告了更负的zeta电位、粒径适度减小以及蛋白质溶解度小幅增加。在机理层面，这些作者提出脉冲电场可能诱导影响二级结构的分子极化效应，并可能通过自由基途径影响二硫键相关化学，从而在不施加强烈机械应力的情况下降低表面疏水性。然而，支持这些机理解释的直接证据仍然有限。Morais等（2023）进一步报道，对0.25%（w/v）的再水化微胶乳酪蛋白分离物在模拟乳超滤液中过夜水化后进行脉冲电场处理，与后续胃消化过程中结构变化和生物活性肽生成增加有关。与这些再水化后处理方法不同，Raghunath等（2024）对喷雾干燥前总固形物为21%的液态MCC施加脉冲电场，并观察到所得粉末再水化时粘度降低。尽管假设脉冲电场可能削弱超分子网络并促进未水化物质的重新溶解，但该机制需要在受控且可比的再水化条件下进行验证。除了脉冲电场外，Hemar等（2020）将高压和超声结合用于从5%（w/v）的再水化酪酸钠制备的重组酪蛋白微胶乳（过夜水化后），报告了微胶乳尺寸减小，但未发现蛋白质裂解的证据。

综合来看，这些研究支持了超声和脉冲电场改善再水化酪蛋白功能的潜力，但仍有若干局限性阻碍了稳健工艺设计空间的定义及其向工业条件的转化。首先，许多已发表的研究依赖于0.25–1%（w/v）范围内的稀蛋白质浓度，远低于典型的高蛋白饮料配方。在这种稀释条件下，蛋白质-蛋白质相互作用预计较弱，微胶乳行为更接近孤立粒子，这意味着结构或功能反应可能无法转化至微胶乳间相互作用主导流变学和聚集的浓缩环境。其次，缺乏在严格等效条件下对超声和脉冲电场的系统比较，特别是在蛋白质浓度、再水化方案、处理介质、热管理和分析方法方面。第三，处理过程中的温度控制通常记录不充分或通过被动冷却处理，尽管众所周知蛋白质结构、聚集状态以及空化或电穿孔效率对温度高度敏感，这可能会损害可重复性并混淆机理解释。最后，所探索的参数空间仍然狭窄，超声研究通常限于短时间和中低功率输入，而脉冲电场研究往往限于适度的电场强度和脉冲持续时间，使得功能改善在能量输入增加时是持续、增强还是逆转尚不确定。

更关键的是，缺乏对再水化酪蛋白体系工艺-结构-功能关系的系统理解，尤其是关于热稳定性方面。对于工业相关的MCC粉末，这一知识空白尤为突出。虽然研究通常记录了处理期间热控制的必要性，但超声或脉冲电场对超分子组织及其导致的热行为的直接影响很少被量化。这一遗漏意义重大，因为热稳定性是经过超高温热处理的高蛋白饮料成功配方的关键性能指标。

因此，本研究旨在通过评估超声和脉冲电场作为MCC粉末再水化早期阶段的辅助分散处理来解决这些空白。具体来说，本研究旨在回答三个问题：(i) 超声和脉冲电场是否可减少粗颗粒粉末衍生的部分并改善最小水化MCC悬浮液的可加工性；(ii) 两种技术是否影响相同的胶体性质，包括粒径分布、沉淀、表观粘度、zeta电位和可溶性钙；(iii) 这些功能性变化是否与可检测的热响应或二级结构修改相关。为此，采用在严格热控制下再水化的商业MCC粉末悬浮液（5% w/w）进行了受控比较，处理温度维持在32°C以下。实施了析因设计，评估了4种超声持续时间（550瓦和20千赫兹）以及3种脉冲电场强度（5000纳秒脉冲宽度和20赫兹），从而将操作窗口扩展至通常酪蛋白体系所报道的范围之外。处理后，对可溶性钙浓度、粒径分布、表观粘度、沉淀行为、zeta电位和表面疏水性进行了表征。通过差示扫描量热分析进一步评估了热稳定性，通过傅里叶变换红外光谱评估了二级结构。这种综合方法旨在建立结构-功能关系，以支持合理的工艺选择和参数调节，为进一步开发高蛋白乳制品饮料的再水化策略奠定基础。

研究片段

材料

微胶乳酪蛋白浓缩物粉末（Promilk? 852B）从Ingredia S.A.（法国阿拉斯）获得，含蛋白质84.31%（w/w）、灰分7.2%、乳糖1.56%和总钙2.4%。8-氨基-1-萘磺酸（ANS）从Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）购买。钙储备液从SCP Science（加拿大魁北克）获得，DORM-5认证鱼蛋白参考材料从加拿大国家研究委员会（加拿大渥太华）获得。

样品制备

MCC粉末

粒径分布

对再水化微胶乳酪蛋白悬浮液的粒径分布进行了分析，以评估每种处理的结构影响。未处理对照样品在初步再水化后表现出单峰分布，几乎完全由超过100微米的大块未溶解聚集体组成（图1A，对照）。超声处理诱导了这些大聚集体的渐进性和时间依赖性崩解。如图1A所示，粗颗粒部分开始……

结论

本研究对高强度超声和连续脉冲电场处理应用于微胶乳酪蛋白悬浮液进行了平行比较，使用统一的分析方法评估其对再水化行为和界面性质的影响。两种技术诱导了不同的结构和胶体反应。脉冲电场促进了钙的溶解和胶体性质的变化，而超声促进了钙的螯合、电荷暴露和增加……

CRediT作者贡献声明

Brayan Castulovich：撰写——初稿，方法论，调查研究，形式分析，数据整理。
Lucas Sales Queiroz：监督，方法论，数据整理，概念设计。
Aberham Hailu Feyissa：监督，方法论，数据整理，概念设计。
Manon Hiolle：可视化，项目管理，资金获取。
Céline Lesur：可视化，验证，项目管理。
Benoit Cudennec：可视化，验证，监督。
Guillaume Delaplace：

未引用参考文献

Broyard and Gaucheron, 2015
Horne, 2017

利益冲突声明

作者声明以下财务利益/个人关系，可能被视为潜在的利益冲突：Brayan Castulovich报告获得了法国国家研究署（ANR）的资金支持。

Brayan Castulovich 声明获得了 Ingredia Dairy Experts 的财务支持。Brayan Castulovich 声明获得了法国2030计划、SFRI项目GRAEL（ANR-21-SFRI-005）的财务支持。Federico Casanova 声明获得了 FOODHAY 的财务支持。致谢：本研究得到了法国国家研究署（ANR）通过 ProteinoPeps 项目提供的设施支持，用于开展这些实验。本研究也得到了 Ingredia Dairy Experts 的支持，他们提供了胶束酪蛋白粉。本工作在丹麦技术大学（DTU）食品研究所的支持下完成，所有实验均在该研究所进行。本研究得到了法国政府通过"法国2030"计划（SFRI项目GRAEL/ANR-21-SFRI-005）的支持。Brayan Castulovich|Lucas Sales Queiroz|Aberham Hailu Feyissa|Manon Hiolle|Céline Lesur|Benoit Cudennec|Guillaume Delaplace|Federico Casanova UMET CNRS实验室，INRAE，UMR 8207-UMET-PIHM，里尔大学，法国维勒纽夫达斯克