开发一种乳糖补充的无抗生素宿主-载体平台，用于在发酵乳杆菌217?82中实现稳定酶表达

《World Journal of Microbiology and Biotechnology》：Development of a lactose-complemented antibiotic-free host-vector platform for stable enzyme expression in Limosilactobacillus fermentum 217???82

　　

摘要

食品级微生物生物加工需要遗传稳定且不含抗生素的宿主-载体系统，以适配食品相关应用。然而，将Limosilactobacillus fermentum作为生物制造底盘受到DNA递送效率低下以及缺乏菌株适配的食品级筛选策略的限制。本研究在L. fermentum 217 ? 82中建立了一个概念验证性的乳糖互补无抗生素宿主-载体框架。首先建立了一套高效的电转化方案作为宿主工程改造的关键步骤，转化效率达到7.50 × 10? CFU/μg DNA。分别对lacM和lacLM基因进行靶向研究，验证了它们在乳糖利用中的参与作用，随后的基因灭活实验确认了它们作为代谢互补标记的有效性。通过将E. coli中的lacZα辅助质粒筛选与L. fermentum中宿主特异性lacM/lacLM介导的乳糖互补相结合，构建了无抗生素穿梭载体。所得重组菌株在连续传代过程中保持质粒稳定性，并支持顺式脯氨酸4-羟化酶的异源表达。利用顺式脯氨酸4-羟化酶进行的验证表明，该平台支持全细胞L-脯氨酸向羟脯氨酸的生物转化，羟脯氨酸产量达到147.62 μg/mL。这些发现证明了在L. fermentum 217 ? 82的菌株适配宿主-载体框架中整合乳糖依赖性筛选、稳定无抗生素质粒维持、功能性异源酶表达和全细胞生物转化的可行性。尽管更广谱的适用性仍需使用其他异源蛋白和工艺条件进行验证，但已建立的框架为未来开发更具普适性的L. fermentum无抗生素表达平台提供了方法学基础。