冷却塔生物膜对微生物生态与军团菌多样性的重要性

《Environmental Science: Water Research and Technology》：Importance of biofilms for the microbial ecology of cooling towers and Legionella diversityOpen Access

　　

由军团菌（Legionella）引起的军团菌病（Legionnaires' disease, LD）病例数在全球范围内不断增加。军团菌可通过冷却塔（cooling towers, CTs）产生的气溶胶传播给人类，使其成为军团菌病暴发的主要来源。军团菌在冷却塔内的生长依赖于以其他微生物为食的阿米巴虫和纤毛虫的存在。以往研究大多关注冷却塔水相微生物组，对生物膜微生物组在军团菌生长中的作用认识不足。本研究对5座运行中的冷却塔的水和生物膜样本进行了分析，以定量军团菌并通过16S和18S rRNA基因扩增子测序确定微生物群落。研究结果表明，每座冷却塔拥有独特的微生物组，且在同一冷却塔内，水相与生物膜微生物组存在差异，这可能是由冷却塔特性和管理策略驱动的。此外，来自嗜肺军团菌（L. pneumophila）培养阳性冷却塔的生物膜具有更高的微生物多样性，并且已知支持嗜肺军团菌在生物膜中生长的微生物丰度更高。在生物膜中检测到子囊菌（Ascomycetes），提示其在冷却塔生态中可能具有作用。阿米巴群落因冷却塔和样本类型而异。虽然蠕阿米巴（Vermamoeba (Hartmanella) vermiformis）在所有冷却塔中普遍存在，但棘阿米巴（Echinamoebae）仅存在于培养阳性冷却塔中，提示其在冷却塔内嗜肺军团菌存活中发挥作用。位点和阶段特异性的军团菌扩增子序列变体（amplicon sequence variants, ASVs）表明，水样中军团菌菌株的周期性检出可能取决于其从生物膜中的释放。这些发现强化了应优先考虑生物膜控制的观点，并建议在军团菌病暴发源头鉴定中考虑生物膜采样。

**研究背景与目的**
军团菌病（LD）是由军团菌（Legionella）引起的严重肺炎，死亡率约为10%，近年来全球发病率持续上升。冷却塔（CTs）通过蒸发散热产生含菌气溶胶，是LD暴发的主要来源。军团菌在CT内的增殖依赖于阿米巴和纤毛虫等原生动物，这些宿主以其他微生物为食。然而，以往研究多聚焦于CT水相微生物组，对生物膜在军团菌生态中的作用认识不足。为此，研究人员对加拿大蒙特利尔5座运行中的全尺寸机械通风CT（S-A、S-C、S-E、S-F、S-G）进行采样，旨在比较水相与生物膜微生物群落差异，描述生物膜中军团菌及其宿主类群，并鉴定与嗜肺军团菌（L. pneumophila）培养阳性相关的微生物特征。

**主要技术方法**
样本队列来自蒙特利尔5座运行中CT的水槽水及可见生物膜。采用改良的非饮用水Legiolert?液体培养法定量嗜肺军团菌，同时使用qPCR（microproof? Legionella Quantification LyoKit）检测军团菌属、嗜肺军团菌及其血清群1（SG1）。微生物群落通过Illumina MiSeq平台对16S rRNA基因V4区和18S rRNA基因V9区进行扩增子测序；测序数据经MOTHUR处理，分别以RDP V19和PR2 5.0.0数据库注释，并采用ANOVA、Kruskal–Wallis、AMOVA、HOMOVA及LEfSe等进行统计。

**研究结果**
**3.1 冷却塔的特性**
5座CT的容量、杀菌方案和管理策略各异，采样时水温为21–28 °C。qPCR在所有位点的水和生物膜中均检出军团菌属；S-A、S-E、S-G的水和生物膜中检出L. pneumophila DNA；培养法仅在S-A、S-F、S-G中检出可培养L. pneumophila，水样平均值为8739 MPN L^?1。

**3.2 微生物群落具有CT特异性**
16S rRNA基因测序共获得19门403属，优势门为Pseudomonadata（73.31%）；18S rRNA基因测序获得31亚门74纲，优势亚门为Gyrista（26.19%）。Bray–Curtis beta多样性分析显示，细菌（AMOVA P < 0.001）和真核（AMOVA P < 0.001）群落在不同CT间差异显著。军团菌、纤毛虫和阿米巴群落也均表现出CT间显著差异，提示CT的设计、运营管理及季节性条件共同选择了独特的微生物组。

**3.3 生物膜和水相微生物群落不同**
水相中优势细菌为Nevskia（19.46%）、Erythrobacter（9.71%）和Comamonadaceae_unclassified（9.67%）；生物膜中为Comamonadaceae_unclassified（8.09%）、Sphingosinicella（5.95%）和Hydrogenophaga（5.03%）。真核群落中，水相以Chrysophyceae（28.39%）为主，生物膜以Eustigmatophyceae（15.38%）为主。细菌alpha多样性在水相和生物膜间显著不同（ANOVA P = 0.04），且两相间的细菌和真核群落组成均差异显著（AMOVA P < 0.001）。LEfSe分析显示，水相预测ASV包括Aquicella、Aeromonas等，生物膜预测ASV包括Hydrogenophaga、Methylobacterium等。军团菌ASV总数在水相中显著更高（ANOVA P = 0.0259），水相与生物膜的军团菌群落组成亦存在差异（AMOVA P = 0.018），表明生物膜中周期性释放的军团菌可能影响水相检出结果。

**3.4 冷却塔生物膜群落对L. pneumophila的重要性**
在生物膜样本中，L. pneumophila培养阳性CT的细菌群落多样性显著高于阴性CT（ANOVA P = 0.0004），且富集Methylobacterium、Hydrogenophaga、Pseudomonas等已知参与生物膜形成或定殖的菌属。同时，培养阳性生物膜中L. pneumophila宿主（如Tetrahymena、Echinamoeba）以及4种子囊菌ASV的丰度更高。相比之下，培养阴性样本中富集Gemmatimonas和LM74谱系阿米巴等类群，提示某些生物膜相关真核生物可能抑制L. pneumophila的存活。

**讨论与结论**
本研究证实了生物膜在冷却塔军团菌生态中的核心作用。CT特异性及相特异性环境选择不同的阿米巴和纤毛虫群落，进而塑造差异化的军团菌群落结构。生物膜中普遍存在的Vermamoeba (Hartmanella) vermiformis构成军团菌扩增的潜在风险。研究结果强调，应优先考虑生物膜控制措施，并在LD暴发调查中将生物膜采样纳入常规策略。研究结论为：每座CT的微生物组受当地及季节性条件选择而各不相同；水相与生物膜因微生物生活方式偏好而呈现明显差异；子囊菌在高度多样性的生物膜中丰富，其生态作用亟待评估；仅依赖水相采样进行源头追踪可能不充分，生物膜监测对军团菌病防控至关重要。