水产养殖样品中多种弧菌同步检测的多重定量PCR(qPCR)方法的开发

《Journal of Fish Diseases》：Development of a Multiplex Quantitative PCR Assay for Simultaneous Detection of Multiple Vibrio Species in Aquaculture Samples

　　

水产养殖相关弧菌（Vibrio spp.）是重要的细菌性病原体，可在水产养殖中造成重大经济损失，并引起人类人兽共患感染。因此，快速准确地检测弧菌对于诊断、监测和控制至关重要。本研究开发了一种多重定量PCR（qPCR）检测方法，可同时检测弧菌属（Vibrio spp.）以及溶藻弧菌（V. alginolyticus）、鳗弧菌（V. anguillarum）、哈维弧菌（V. harveyi）、奥氏弧菌（V. ordalii）、副溶血弧菌（V. parahaemolyticus）、创伤弧菌（V. vulnificus）和霍乱弧菌（V. cholerae）。研究人员设计了靶向ompA、谷氨酸合酶、mreB、vohB、dnaJ、gyrB和lolB基因的种特异性引物和探针，并选择rpoA基因用于弧菌属水平的检测。该检测方法对所有目标菌株表现出100%的包容性，与非目标细菌物种无交叉反应。PCR效率/抑制分析显示，在系列稀释中扩增动力学稳定，所有靶标的R²值高于0.99，扩增效率在96.8%至98.2%之间，ΔCq值≤0.13。使用人工污染基质进行的检测限（LOD）研究表明，所有靶标的检测限为10¹–10⁰ CFU/mL，检测性能与基于培养的回收方法相当。总之，所开发的多重qPCR检测方法为同时检测与水产养殖和人兽共患感染相关的多种弧菌提供了一种快速、灵敏且分析可靠的方法。

弧菌属（Vibrio）是水产养殖中常见的细菌性病原体，可导致鱼类和贝类疾病，造成生长率下降、死亡率升高和产品质量恶化，同时可通过食用受污染水产品或伤口接触引起人类弧菌病（vibriosis）和霍乱等人兽共患感染。传统诊断方法主要依赖基于培养的细菌分离和生化鉴定，但培养法费时费力，在硫代硫酸盐柠檬酸盐胆盐蔗糖（TCBS）琼脂平板上直接菌落计数易低估细菌载量，且弧菌属内近缘种在形态、毒力因子和基因组特征上高度相似，常难以在种水平可靠区分。现有分子检测方法多针对有限数量的弧菌种类，缺乏能够同时覆盖水产养殖和临床相关多种弧菌及属水平靶标的综合检测手段。因此，研究人员开发了一种多重定量PCR（qPCR）方法，用于同时检测弧菌属及7种重要弧菌，以支持快速诊断、监测和疾病控制。

研究人员共纳入88株细菌，包括目标弧菌的参考菌株和田间分离株，以及11种非目标近缘水生细菌。田间分离株来自水产养殖相关样本，保存于土耳其安卡拉大学兽医学微生物学系，物种身份经基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）确认；参考菌株购自德国微生物菌种保藏中心（DSMZ）。研究人员针对rpoA基因设计属水平引物和探针，针对溶藻弧菌的ompA、鳗弧菌的谷氨酸合酶、哈维弧菌的mreB、奥氏弧菌的vohB、副溶血弧菌的dnaJ、创伤弧菌的gyrB和霍乱弧菌的lolB基因设计种特异性引物和探针，采用FAM、ROX和Cy5荧光标记，并引入HEX通道的外源扩增/抑制对照。检测体系配置为四管多重qPCR面板，采用磁感应循环仪和降落式循环条件。研究通过系列稀释评估PCR效率和抑制，通过目标菌株和非目标菌株测试选择性，并通过人工污染鱼组织和鸡泄殖腔拭子样本评估检测限（LOD），同时与培养回收方法进行比较。

结果方面，3.1 PCR效率/抑制（PCR Efficiency/Inhibition）：通过从1/2到1/1024的6点4倍系列稀释对全部8个靶标进行检测，所有靶标的标准曲线均显示良好线性，R²值介于0.9985至0.9993之间，斜率介于?3.365至?3.401之间，扩增效率介于96.8%至98.2%之间，均符合预设接受标准；所有靶标的ΔCq值≤0.13，低于0.5的阈值，表明未出现显著PCR抑制。3.2 选择性（Selectivity）：针对每种弧菌的10个田间分离株和参考菌株进行检测，属水平rpoA检测可扩增所有目标弧菌，各菌种特异性引物和探针仅扩增对应靶标，未观察到交叉扩增；11种非目标菌（包括气单胞菌属、爱德华氏菌属、耶尔森氏菌属、链球菌属、乳球菌属、大肠杆菌和肠道沙门氏菌）均无扩增信号，同时内部抑制对照有效扩增，证实了检测方法的分析特异性；NCBI Primer-BLAST和序列比对也显示引物和探针结合区域无非靶标同源性。3.3 检测限（Limit of Detection, LOD）：在人工污染的鱼组织和鸡泄殖腔拭子中，当污染水平为10²–10¹ CFU/mL时，所有靶标的检出率为20/20（100%）；当污染水平为10¹–10⁰ CFU/mL时，所有靶标的检出率为19/20（≥95%），平均Cq值介于23.12至24.80之间；培养回收方法在相同条件下均为20/20阳性。因此，该多重qPCR方法的分析检测限确定为10¹–10⁰ CFU/mL，与基于培养的回收方法检测性能相当。

讨论部分指出，所开发的多重qPCR检测方法能够在四管检测面板中同时检测7种弧菌和属水平目标，这较以往仅针对少数几种病原体的方法更为全面。与已有的针对溶藻弧菌、鳗弧菌、哈维弧菌和迟钝爱德华氏菌的常规多重PCR相比，本研究额外增加了副溶血弧菌、创伤弧菌、霍乱弧菌等具有人兽共患意义的物种，并引入了内部抑制对照，增强了诊断可靠性。研究还通过与培养回收方法的比较，在更贴近实际水产养殖样本的条件下验证了检测性能。该方法的局限性在于未使用大量自然感染的实际样本进行前瞻性验证；未来需要将四管检测面板与参考诊断程序在自然感染样本中对比评估，再用于常规诊断。

研究结论可翻译为：本研究开发的多重qPCR检测方法在四管面板中表现出高分析特异性、灵敏度，以及稳定的扩增性能和可靠的平行多靶标检测能力。此外，该方法包含了弧菌属水平检测和内部抑制对照，从而提高了常规分析中的诊断可靠性。所开发的多重qPCR检测方法可为水产养殖与人兽共患感染相关弧菌的常规监测、快速病原体检测和早期预警提供一种实用且高效的工具。