基于1H NMR代谢组学与化学计量学分析的巴西南里奥格兰德州特级初榨橄榄油：新兴特级初榨橄榄油产区的首次表征

《JOURNAL OF FOOD QUALITY》：1H NMR-Based Metabolomic Profiling and Chemometric Discrimination of Brazilian Olive Oils From Rio Grande do Sul: First Characterization of a New Extra Virgin Olive Oil Frontier

　　

特级初榨橄榄油（extra virgin olive oil，EVOO）是一种高价值产品，其品质与组成密切相关，因此易受欺诈和错误标签的影响。因此，需要快速、无损的工具来支持真实性评估。尽管巴西的油橄榄种植不断扩大，但针对该国主要产州、同时也是新兴产区南里奥格兰德州的EVOO，尚缺乏系统化的代谢组学表征。本研究采用¹H NMR波谱技术分析了来自南里奥格兰德州的155份EVOO样品（2022–2024年收获季），覆盖了主要商业栽培品种。研究人员选取了平衡的61份样品子集进行化学计量学建模。波谱数据（CDCl₃，298 K）经NMRProcFlow处理，进行分段积分（bucketing）、归一化及帕累托缩放（Pareto scaling）。研究采用了主成分分析（principal component analysis，PCA）、PERMANOVA、偏最小二乘判别分析（partial least squares discriminant analysis，PLS-DA）、置换检验及受试者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）分析。波谱显示出高品质EVOO特有的脂质谱图。同时观察到与品种和收获季相关的细微但一致的差异。PCA表明不同品种存在部分聚类，PERMANOVA证实了显著的品种效应（p = 0.006）。PLS-DA模型能够区分正宗EVOO与大豆油（R²Y = 0.69，Q² = 0.40；置换检验p = 0.002）。ROC分析得到AUC = 0.996，灵敏度为80.0%，特异性为100.0%。判别变量主要与多不饱和脂肪酸相关（双烯丙基质子约2.8 ppm，n-3末端甲基约0.98 ppm）。本研究首次对南里奥格兰德州的EVOO进行了基于¹H NMR的系统化代谢组学表征，并展示了¹H NMR化学计量学作为新兴橄榄油产区真实性与掺假检测快速筛查工具的潜力。

**一、研究背景与研究目的**

特级初榨橄榄油（extra virgin olive oil，EVOO）是地中海饮食的核心组分，因其风味和健康功效而备受重视，其组成富含单不饱和脂肪酸（尤其是油酸）以及酚类、生育酚和类胡萝卜素等微量活性成分。巴西虽已开展油橄榄种植，但全国约98%的消费量依赖进口，且进口油多以散装形式在非理想条件下运输，增大了品质劣变和人为掺假风险。橄榄油的高价值和复杂供应链使其容易成为欺诈目标，常见手段包括掺入廉价植物油、产地和等级虚假标注等。在巴西，南里奥格兰德州贡献了全国约70%–75%的产量，是该国最主要的产区和新兴生产前沿。然而，该州EVOO的代谢组学特征尚无系统报道，既往研究多集中在常规品质指标、脂肪酸组成和感官特征方面，基于非靶向核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）代谢组学的研究尚属空白。为填补这一空白，本研究旨在通过¹H NMR代谢组学方法，首次系统表征南里奥格兰德州2022–2024三个收获季的EVOO，评估品种和收获年对代谢组学谱图的影响，并检验¹H NMR指纹图谱在区分正宗EVOO与大豆油及掺假相关组成偏差中的能力，以期为巴西橄榄油真实性评估和区域光谱数据库建设奠定基础。

**二、研究总体设计与主要结论**

研究共获得由巴西油橄榄种植研究所（IBRAOLIVA）提供的155份来自南里奥格兰德州不同油橄榄种植区的EVOO样品，涵盖Arbequina、Arbosana、Coratina、Frantoio、Galega、Koroneiki、Maraiolo（或Moraiolo）和Picual等主要商业品种。由于完整数据集在品种–收获季组合上存在严重的类别不平衡，研究人员挑选了61份样品构成严格平衡的子集用于化学计量学建模，以确保多元分析的可靠性和可解释性。所有样品经20 μL油样溶于500 μL氘代氯仿（CDCl₃）的最小化预处理后，在300.18 MHz的Bruker UltraShield波谱仪上于298 K采集一维¹H NMR谱。波谱经NMRProcFlow处理后，在0.5–9.5 ppm区间进行固定宽度分段积分，并依次进行总加和归一化（total sum scaling，TSS）和帕累托缩放（Pareto scaling）。多元统计分析包括主成分分析（principal component analysis，PCA）、PERMANOVA、偏最小二乘判别分析（partial least squares discriminant analysis，PLS-DA）、置换检验和受试者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）分析。研究结果显示，南里奥格兰德州EVOO的¹H NMR谱图呈现出高品质橄榄油的典型脂质特征，端甲基、脂肪链亚甲基、烯丙基、双烯丙基、羰基α-亚甲基、甘油骨架和烯烃质子信号清晰可辨，确认了以富含油酸的三酰甘油为主的组成模式。谱图间存在细微但一致的品种和收获差异；PCA显示品种相关的部分聚类趋势，PERMANOVA确认了显著的品种效应（p = 0.006），且BETADISPER分析排除了组内离散度差异对结果的干扰。针对正宗EVOO与大豆油的PLS-DA判别模型表现出良好的解释能力和中等预测能力（R²Y = 0.693，Q² = 0.398，置换检验p = 0.002），ROC交叉验证得到AUC = 0.9964，灵敏度为80.0%，特异性为100.0%，总体准确率为98.3%，载荷分析表明多不饱和脂肪酸相关谱区（双烯丙基质子约2.8 ppm、n-3末端甲基约0.98 ppm）是区分的关键变量。该研究首次从代谢组学层面证实了南里奥格兰德州生产的EVOO符合高品质特级初榨标准，且具备品种相关的化学指纹特征，并能与大豆油及掺假类似型组成偏差进行可靠区分，对确立该州作为全球新兴橄榄油产区的科学地位具有里程碑意义。

**三、关键技术方法**

本研究采用的关键技术方法包括：（1）¹H NMR波谱技术，选用zg30脉冲序列，32次扫描，弛豫延迟1 s，采集时间3.14 s，谱宽覆盖0–10 ppm，化学位移以CHCl₃残峰（7.27 ppm）定标；（2）NMRProcFlow波谱处理流程，包括傅里叶变换、相位和基线校正、化学位移对齐、溶剂区去除及固定宽度分段积分；（3）总加和归一化与帕累托缩放的数据预处理策略；（4）PCA和PERMANOVA非监督探索性分析；（5）PLS-DA监督分类模型结合交叉验证、500次置换检验和ROC曲线分析。样品队列来源于巴西南里奥格兰德州的主要油橄榄种植区，覆盖2022–2024三个收获季的155份EVOO样品，其中61份平衡子集用于化学计量学建模。

**四、研究结果**

**4.1 来自巴西新产区的EVOO的¹H NMR表征**

南里奥格兰德州EVOO的¹H NMR谱图显示出橄榄油典型的脂质谱图，端甲基（0.8–1.0 ppm）、脂肪链亚甲基（1.2–1.4 ppm）、烯丙基（2.0 ppm）、双烯丙基（2.7–2.8 ppm）、羰基α-亚甲基（2.3–2.4 ppm）、甘油骨架（4.1–4.3 ppm）和烯烃质子（5.3–5.4 ppm）信号均清晰存在，确认了以富含油酸的甘油三酯为主的组成，与地中海和南半球橄榄油的典型EVOO组成一致。这一结果表明，在高纬度南缘的新兴产区，¹H NMR脂质指纹图谱与既有高品质特级初榨油的典型特征相符。

**4.2 区分橄榄油与大豆油的波谱标志物**

将Koroneiki品种EVOO（2022–2024收获季）与大豆油谱图对比后发现，大豆油中多不饱和脂肪酸含量更高，表现为双烯丙基CH₂信号（约2.8 ppm）显著增强、n-3端甲基信号（约0.98 ppm）更强烈，以及烯丙基和烯烃区相对贡献的改变。这些特征与既往利用NMR检测大豆油等多不饱和油脂掺假的研究一致。所分析的巴西EVOO未呈现这些特征，表明该批样品未发生大豆油掺假。

**4.3 品种和收获效应：PCA与PERMANOVA**

全局PCA显示各品种间存在较大重叠，但得分分布呈现出与品种和收获条件相关的细微趋势。PERMANOVA确认品种对整体代谢组谱图有显著影响（p = 0.006）。PC1和PC2得分的箱线图展示了不同品种间的分布差异，BETADISPER分析未发现组内离散度的显著差异，验证了PERMANOVA结果反映的是真实的组成差异而非组间方差不齐。

**4.4 新兴产区中组成偏差与掺假的检测**

PLS-DA模型以三个潜变量构建，区分正宗EVOO与大豆油及组成偏差样品，模型R²Y = 0.693、Q² = 0.398，500次置换检验p = 0.002，确认了模型架构的统计显著性。ROC分析显示AUC = 0.9964，对掺假相关组成偏差的检出灵敏度为80.0%，对正宗EVOO的特异性为100.0%，总体准确率98.3%。PCA对EVOO和大豆油合并数据集的探索性分析中，PC1和PC2分别解释了18.2%和12.4%的方差，无监督模型即能捕捉二者的代谢组学差异。载荷图表明多不饱和脂肪酸相关谱区是判别的主要贡献变量。

**4.5 对巩固南里奥格兰德州作为新橄榄油产区的意义**

研究提供了南里奥格兰德州EVOO具有高品质特级初榨组成、品种相关化学特征以及可稳健区分大豆油和掺假型剖面等三方面的首批代谢组学证据。这些发现一方面印证了巴西南部特别是南里奥格兰德州的土壤气候条件能够生产化学组成优良的EVOO，支持该州作为全球新兴产区的定位；另一方面，品种特异性NMR代谢组学差异的记录为未来区域典型性标志和原产地认证的开发提供了基础。此外，简单的¹H NMR实验结合易获取的多元统计工具即可检出掺假相关组成偏差，为巴西监管部门纳入常规监控提供了可行路径。该研究建立的首批南里奥格兰德州EVOO波谱与化学计量学区域数据库，为今后跨年度气候变异、果园管理措施和新品种等方向的纵向研究奠定了基础。

**五、结论与讨论**

本研究首次通过代谢组学指纹图谱表征了巴西南里奥格兰德州这一新兴生产前沿EVOO的特征脂质谱图，并通过PCA和PERMANOVA揭示了与品种相关的细微组成趋势。化学计量学模型利用多不饱和脂肪酸相关谱区作为关键标志物，实现了正宗EVOO与大豆油及组成偏差样品的良好区分，AUC约0.996，特异性高且灵敏度可接受。同时，¹H NMR作为一种快速、无损、低前处理要求的工具，适用于筛查和常规质量控制。上述结果证明，基于¹H NMR的代谢组学分析是常规理化分析的有力补充，特别是在新兴橄榄油产区。所生成的波谱和化学计量学数据构成了南里奥格兰德州EVOO的首个NMR区域数据库，为原产地真实性鉴别、年际变异和更广泛欺诈场景的后续研究奠定了基础。通过记录巴西南部EVOO的代谢组学身份，该研究有助于巩固南里奥格兰德州作为全球舞台上经科学表征的高品质橄榄油生产新前沿的地位。