《The FEBS Journal》：High-resolution spatial transcriptomic atlas of mouse soleus muscle: Unveiling single cell and subcellular heterogeneity in health and denervation
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摘要专业翻译
骨骼肌表现出显著的细胞和亚细胞异质性，但基于细胞/细胞核解离的方法会丢失组织结构，而空间平台又存在分辨率不足或转录组覆盖有限的问题，因此全面的空间图谱构建一直受到限制。研究人员在此呈现了小鼠比目鱼肌纵切面的高分辨率空间转录组图谱，具有无偏的全转录
摘要专业翻译
骨骼肌表现出显著的细胞和亚细胞异质性，但基于细胞/细胞核解离的方法会丢失组织结构，而空间平台又存在分辨率不足或转录组覆盖有限的问题，因此全面的空间图谱构建一直受到限制。研究人员在此呈现了小鼠比目鱼肌纵切面的高分辨率空间转录组图谱，具有无偏的全转录组覆盖，能够在保留肌纤维全长亚细胞表达结构域的同时实现肌纤维分辨率的转录组分析。研究人员将组织学引导的肌纤维分割与无偏的网格化映射相结合，恢复了经典肌纤维类型，并揭示了广泛的原位杂交型肌纤维状态（hybrid myofiber states），包括在比目鱼肌中罕见、仅在评估肌纤维内异质性时才显现的IIb型相关特征。在亚细胞尺度上，研究人员将神经肌肉接头（NMJ）描绘为一个多区室微环境，包含突触后肌核以及空间上截然不同的突触周围区和髓鞘形成施万细胞相关区，每个区室均具有特征性基因程序。将该框架应用于去神经支配（3天和7天）研究，可识别出稳健的纤维类型特异性应激反应、巨噬细胞和成纤维细胞转录组的协调重塑，以及显著的肌纤维内异质性，包括沿单个肌纤维的损伤反应基因的空间非均匀激活，在NMJ近端和远端具有不同的转录结构域，并伴有相关的退行性组织学特征。总之，该图谱为肌肉生物学提供了高分辨率参考，并阐明了去神经支配如何在完整组织内重塑肌纤维、突触和基质-免疫程序。
论文解读
一、研究背景与意义
骨骼肌在运动、姿势维持和代谢调节等众多生理过程中发挥着至关重要的作用，其结构极为复杂，包含多种功能与代谢特性各异的肌纤维类型，并与卫星细胞、免疫细胞、成纤维细胞、内皮细胞和神经相关施万细胞等非肌细胞交织分布。骨骼肌对神经输入具有深度依赖性，去神经支配会导致快速萎缩和功能损伤，这一过程不仅与创伤性损伤和多种神经肌肉疾病相关，在衰老进程中也扮演重要角色。因此，全面理解骨骼肌的精细结构与功能，涵盖其异质性及与神经输入的复杂相互作用，对于推进肌肉生理学认知、开发神经肌肉疾病靶向疗法以及应对衰老相关肌肉退化挑战至关重要。
单细胞转录组技术在揭示多种生物系统细胞异质性方面带来了重要见解，但在骨骼肌研究中的应用面临独特挑战。肌纤维细长且多核的结构不适用于为标准设计的单核细胞分选技术。单核RNA测序（snRNA-seq）虽能揭示肌肉细胞的转录组异质性，但仅捕获核转录组，可能遗漏细胞质中的关键信息，更重要的是无法提供这些细胞核在肌纤维不同区域空间组织方式的直接信息。空间转录组技术虽能保留基因表达的空间背景，但现有平台如10X Visium分辨率往往过粗，难以区分单个细胞或亚细胞结构，且此前研究多基于横切面，难以解析神经肌肉接头等特化区域的细胞类型。为克服这些局限，研究人员采用Seq-Scope技术，该技术提供亚微米级空间分辨率和全转录组覆盖，能够在肌纤维纵轴方向实现单细胞和亚细胞水平的基因表达精确定位。
二、研究内容与主要发现
研究人员利用Seq-Scope的HiSeq实现，对小鼠比目鱼肌纵切面进行了全面分析。通过坐骨神经横断（SNT）建立去神经支配模型，在术后3天和7天收集组织，以对侧未手术腿作为支配对照。共分析了来自11只动物的32个纵切面，包括未处理对照（C0；3只小鼠，13个切面）、3天支配对照（C3；1只小鼠，2个切面）、7天支配对照（C7；1只小鼠，2个切面）以及3天去神经（D3；2只小鼠，6个切面）和7天去神经（D7；4只小鼠，9个切面）样本。由于C0、C3和C7均为支配状态，这些组被合并作为支配对照参考。研究共检测到7660万条比对到转录组的唯一读数，经质量控制后获得121191个六边形单元，每个单元中位检测248条转录本。
研究采用两种互补的分析策略：组织学引导的肌纤维分割和无偏的六边形网格化空间分箱。在正常肌肉中，通过分割分析获得1355个肌纤维转录组，无监督聚类解析出MF1、MF2A和MF2X三种主要肌纤维类型，其标记基因与既往snRNA-seq研究高度一致，同时发现了此前未检测到的富集基因。六边形网格分析进一步揭示了单个肌纤维内的转录组异质性，检测到MF2A-MF2X和MF2X-MF2B杂交肌纤维状态，其中IIb型相关特征仅在肌纤维内异质性评估时才显现。此外还鉴定出以组织蛋白酶B高表达为特征的MFDEGEN局部转录状态，该状态在正常肌肉中稀疏分布且无一致空间模式。
在亚细胞尺度上，研究人员将神经肌肉接头（NMJ）解析为多区室转录组微环境。通过高分辨率空间映射，清晰区分了以Prkar1a、Etv5和Ufsp1为标记的突触后肌核区域、以Smoc2和Lum为标记的突触周围区以及以Mpz和Pmp22为标记的髓鞘形成施万细胞相关区。这些区室的基因程序与已发表的施万细胞转录组数据高度吻合，其空间排列精确对应NMJ的已知解剖结构。此外，Seq-Scope还稳健检测到巨噬细胞、成纤维细胞、平滑肌细胞、脂肪细胞和红细胞等多种非肌细胞群体，其中巨噬细胞在snRNA-seq数据集中通常难以捕获。
三、关键技术与方法
研究人员采用Seq-Scope超高通量空间转录组平台，该平台基于HiSeq2000流式细胞构建固态转录组捕获阵列，可在同一组织切片上同时获取苏木精-伊红（H&E）染色图像和空间分辨的RNA捕获数据。纵切面组织经透化处理后进行原位逆转录，生成空间条形码cDNA文库并进行配对末端测序。数据分析采用STAR比对生成空间数字基因表达（sDGE）矩阵，通过QGIS软件进行组织学图像与空间数据的半自动配准。下游分析采用两种互补策略：在QGIS中手工绘制多边形进行肌纤维分割，以及14μm边长六边形网格化分箱。数据经Seurat包进行SCTransform归一化、主成分分析、UMAP降维和共享最近邻模块化优化聚类。
四、研究结果
正常肌肉单肌纤维转录组分析。 通过H&E引导分割获得1355个高质量肌纤维转录组，无监督聚类解析出MF1、MF2A和MF2X三种主要纤维类型，由肌球蛋白重链异构体、原肌球蛋白和肌钙蛋白等经典纤维类型标记定义。纤维类型特异性标记基因集与既往snRNA-seq研究基本一致，同时发现新的富集基因。值得注意的是，MF2X纤维高表达线粒体编码转录本，尽管其在比目鱼肌中主要发挥糖酵解功能。
杂交肌纤维转录组的亚细胞解剖。 六边形网格聚类在恢复主要肌纤维类型的同时，额外检测到带有Myh4标记的IIb型相关特征小簇。高分辨率空间映射显示，单个肌纤维内可检测到不同肌纤维类型转录组，包括MF2A-MF2X和MF2X-MF2B杂交状态。由于MF2B纤维在小鼠比目鱼肌中极为罕见，其信号仅在肌纤维内异质性评估时才显现。
神经肌肉接头（NMJ）转录组的鉴定。 六边形聚类鉴定出以Malat1和Neat1高表达为特征的核（NUC）亚结构域，以及以Prkar1a、Etv5、Ufsp1和Chrna1等经典突触后基因富集为特征的NMJ簇。空间投影显示NMJ相关区域精确对应比目鱼肌中NMJ的标志性中线定位，并与组织学终板结构重叠。NMJ标记基因与snRNA-seq鉴定的突触后核标记部分重叠，同时揭示snRNA-seq未捕获的独特特征。
突触后和施万细胞相关NMJ结构域的空间解析。 亚聚类分析显示NMJ群体反映纤维类型特异性转录特征而非分离不同组分，但原生分辨率下的单个标记基因空间分布清晰区分了突触后核标记与施万细胞相关标记。基于Prkar1a、Smoc2和Mpz的空间分离，研究人员分割出三个NMJ相关区域，差异表达分析揭示各自独特的转录程序。突触周围区高表达Lum、Apod、Dcn和Smoc2，与非髓鞘形成施万细胞转录组高度吻合；髓鞘形成施万细胞相关区表达Mpz、Pmp22和Ndrg1等髓鞘形成基因，与髓鞘形成施万细胞转录组一致。
Seq-Scope数据集中非肌细胞的表征。 高分辨率六边形分析鉴定出巨噬细胞、成纤维细胞、脂肪细胞、平滑肌细胞和红细胞等非肌细胞群体，其空间分布与组织微解剖结构精确对应。平滑肌转录组定位于动脉结构周围，脂肪细胞转录组局限于脂质丰富区域。巨噬细胞转录组在snRNA-seq数据集中通常缺失，但在此被稳健检测并空间解析。
去神经支配的纤维类型特异性反应。 对3908个分割肌纤维转录组分析显示，去神经纤维在3天和7天呈现与对照显著不同的转录组状态。D3-MF1富集热休克蛋白（Hspb1、Hspa8）、晶体蛋白（Cryab）和肌肉应激反应蛋白（Csrp3、Ankrd1），以及Xirp1、Flnc、Enah等损伤肌纤维标记，其上调高度特异于氧化型MF1纤维。D3-MF2X则更强上调Hspb8和金属硫蛋白（Mt1、Mt2）。D7纤维上调自噬调控基因、萎缩诱导基因、染色质调节因子（Hdac3）、氧代谢基因（Mb、Car3）以及DNA损伤反应转录本（Cdkn1a、Gadd45a、Mdm2）。
去神经支配反应的亚细胞异质性。 高分辨率空间分析揭示D3-MF1损伤反应转录本在单个肌纤维内呈离散结构域分布，与D7-MF1基因程序区域相邻。这些转录结构域与组织学特征相关：表达D3-MF1标记的区域呈苍白退行性H&E染色，而D7-MF1区域保留较正常的肌纤维形态。D3-MF1损伤反应转录本常在NMJ附近富集，突触后标记保持终板区局限，而损伤反应转录本从突触核心向外辐射至同一肌纤维的邻近节段。
去神经支配维持NMJ标记定位并诱导接头外乙酰胆碱受体。 核心突触后NMJ标记（Prkar1a、Etv5、Ufsp1）在去神经后仍稳健且空间局限于终板相关区域。相比之下，乙酰胆碱受体基因表达发生显著重塑：Chrna1、Chrnb1和Chrng在去神经后于整个肌纤维强烈诱导，接头外表达水平甚至超过其NMJ基线水平；而Chrne表达即使在去神经后仍严格局限于突触后NMJ核。
去神经支配在NMJ突触周围微环境中引发稳健的细胞外基质重塑。 去神经后突触周围标记表达较对照更为空间广泛，提示该区室扩张或激活。差异表达分析显示突触周围微环境中细胞外基质重塑、组织修复、损伤反应和成纤维细胞增殖相关基因上调。空间映射确认这些转录本在去神经肌肉NMJ周围区域富集，支持去神经诱导的突触周围NMJ微环境重塑。
去神经支配的非肌细胞反应。 巨噬细胞群体在去神经后丰度总体增加，7天时标记基因表达水平最高，三个亚群（MACRO1-3）均呈现协调反应。成纤维细胞群体丰度无一致变化，但FIBRO1亚群呈现显著的时序依赖性转录重塑：3天时上调早期损伤和炎症反应相关基因（Col3a1、Cxcl14、Ctsl），7天时转向细胞外基质相关基因（Fn1、Mgp、Dcn）富集。
五、讨论与结论
本研究代表了首个结合显微空间分辨率与无偏基因覆盖的骨骼肌纵切面全转录组空间图谱。与依赖组织解离的scRNA-seq/snRNA-seq及分辨率有限的10X Visium平台相比，Seq-Scope提供了亚微米级空间分辨率和全转录组覆盖，能够在完整肌纤维内和组织微环境中直接可视化转录组组织。两种互补分析策略——组织学引导分割和六边形网格化——产生趋同而不同的结果：分割分析支持稳健的纤维类型分类和纤维类型特异性差异表达分析，网格分析则揭示杂交肌纤维状态、亚细胞转录结构域和局部退行性特征。
研究结果凸显了去神经支配诱导重塑的复杂性。肌纤维水平上，去神经引发纤维类型偏向的转录反应，氧化型和糖酵解型纤维可能参与部分不同的应激反应程序。这些转录变化沿肌纤维非均匀分布，损伤反应基因表达结构域常在NMJ附近富集并与局部退行性组织学特征相关，提示NMJ邻近区域可能作为早期去神经反应的空间组织者。非肌细胞群体呈现不同且时序结构的反应：巨噬细胞丰度和激活进行性增加，成纤维细胞则经历动态转录重塑而非群体大小变化。在NMJ处，去神经维持突触后核的转录身份，同时诱导选择性乙酰胆碱受体亚基的广泛接头外表达，突触周围区域则呈现扩张和细胞外基质及损伤反应基因的稳健诱导。
该图谱为肌肉生物学提供了高分辨率参考框架，揭示了纤维类型间、单个肌纤维内以及多种非肌细胞群体中的异质性，呈现了此前转录组方法无法获取的空间结构化反应。虽然研究基于小鼠模型，需在人类组织和疾病背景下验证，但该图谱为未来神经肌肉病理、衰老和再生研究建立了参考基准，并展示了高分辨率空间转录组学在推进复杂多核组织及其对生理扰动动态反应理解方面的强大能力。
