腹侧下托细胞的分支投射模式揭示海马关键输出在驱动恐惧与焦虑中的复杂整合作用

《Hippocampus》：The Branching Projection Pattern of Ventral Subicular Cells Revealing the Complex Integrative Role of Key Hippocampal Outputs in Driving Fear and Anxiety

　　

海马的腹侧区域通过投射至下丘脑，在情绪反应中发挥关键作用。在此背景下，腹侧海马向内侧下丘脑防御环路各组成部分发出广泛投射，其中投射至前下丘脑核（anterior hypothalamic nucleus, AHN）的纤维同时影响致焦虑反应、先天恐惧反应以及情境恐惧反应。本研究旨在检测直接投射至AHN的海马细胞的分支投射模式，并鉴定驱动恐惧与焦虑的关键海马输出所影响的全脑区域范围。为实现这一目标，研究人员首先利用携带增强型黄色荧光蛋白（enhanced yellow fluorescent protein, EYFP）报告基因的AAV逆行病毒载体，探查了直接投射至前下丘脑区域的海马细胞全貌。研究人员发现，投射至前下丘脑的海马细胞主要分布于腹侧下托的整个头尾轴。随后，通过向前下丘脑核（AHN）注射AAV逆行病毒载体以在投射至前下丘脑区域的下托神经元中特异性插入Cre重组酶，并在下托注射以Cre依赖方式表达膜结合GFP及与红色荧光蛋白mRuby融合的突触前蛋白突触素（synaptophysin）的AAV载体，研究人员研究了投射至AHN的下托神经元的侧支分支模式。结果表明，投射至前下丘脑的腹侧下托神经元呈现出广泛的分支投射模式，连接至参与多种功能的多个脑区，包括记忆、动机、觉醒、昼夜节律、神经内分泌调节以及目标导向行为。这揭示了腹侧下托前下丘脑投射细胞表现出广泛的分支投射模式，使其在驱动焦虑和恐惧行为的同时，能够独特地影响复杂的整合性反应。

腹侧下托神经元投射模式揭示海马关键输出在恐惧与焦虑中的整合作用：研究背景、方法与发现

研究背景与问题

海马环路沿背腹轴功能分化，背侧海马主要参与记忆、空间导航与空间学习，而腹侧海马更倾向于调控情绪反应。已有研究表明，腹侧海马损伤会显著影响恐惧与焦虑相关行为，例如在高架十字迷宫中的防御反应、对猫气味的先天恐惧反应以及条件性恐惧表达。腹侧海马通过其向内侧下丘脑防御环路的投射在恐惧和焦虑中发挥关键作用。该防御环路包括前下丘脑核（AHN）、腹内侧核背内侧区和背侧乳头前核。其中，腹侧下托（ventral subiculum, ventral SUB）向前下丘脑核提供特别广泛的投射，形成腹侧下托-前下丘脑核（SUB–AHN）通路。既往研究证实该谷氨酸能通路参与致焦虑反应、先天恐惧反应和情境恐惧反应，其激活可引发目标导向的逃跑反应，其抑制则损害焦虑样回避行为及面对捕食者线索时的情境记忆提取。然而，此前对腹侧下托投射至AHN的细胞是否具有分支投射、它们还同时影响哪些脑区、以及这些分支投射如何整合多种功能以协同驱动恐惧与焦虑，尚缺乏系统研究。本研究正是基于这一问题，旨在全面鉴定直接投射至AHN的海马细胞分布，并揭示这些细胞在整个脑内的侧支分支模式，以阐明海马关键输出影响复杂整合性反应的解剖基础。

研究方法概述

研究人员采用多种病毒示踪策略。首先，使用携带增强型黄色荧光蛋白（EYFP）报告基因的AAV逆行病毒（AAVretro-CaMKII-EYFP）注射至前下丘脑区域，逆行标记全部直接投射至该区域的海马神经元。随后，采用双病毒交叉策略：将表达Cre重组酶的逆行AAV载体（AAVrg-hSyn-Cre-WPRE-hGH）注射至前下丘脑核（AHN），并在腹侧下托不同头尾水平注射Cre依赖的AAV载体（AAV5-hSyn-FLEx-mGFP-2A-Synaptophysin-mRuby），使仅投射至AHN的下托神经元同时表达膜结合GFP（mGFP）和与mRuby融合的突触素，从而完整显示这些神经元的分支投射全貌。病毒注射后4周进行灌注、脑组织切片，并通过免疫荧光增强GFP信号，在荧光显微镜下观察并采集图像。实验动物为成年C57BL/6野生型小鼠及Ai6 Cre报告小鼠，来自巴西圣保罗大学医学院（FMUSP）饲养 colonies。

研究结果

3.1 投射至前下丘脑区域的海马细胞分布

通过AAVretro-CaMKII-EYFP逆行追踪发现，注射位点主要位于前下丘脑核，并部分扩散至邻近的外侧下丘脑近背内侧区和腹内侧核。逆行标记的细胞主要为锥体神经元，广泛分布于腹侧下托的整个头尾轴，少量标记细胞见于背侧下托，而邻近CA1区仅见零星标记细胞。使用Ai6 Cre报告小鼠进行验证，其ZsGreen1荧光揭示了更为广泛的标记群体，确认腹侧下托是投射至前下丘脑区域的主要海马细胞来源。

3.2 投射至前下丘脑区域的下托细胞侧支分支模式

通过双病毒标记实验，在雄性及雌性小鼠中分别获得位于腹侧下托头侧三分之二、尾侧半部以及背侧下托的注射位点。对照实验仅注射Cre依赖AAV而不注射逆行Cre的动物未见任何标记细胞，证明标记特异性。

3.2.1 腹侧下托头侧三分之二的投射

头侧腹侧下托投射至AHN的细胞分支广泛。在海马内部，它们靶向腹侧下托尾侧部；经角束（angular bundle）投射至颞叶皮层和杏仁核，在内外嗅皮层深层（第4-6层）形成密集终末场，并向内嗅区和颞联合区发送稀疏投射。杏仁核内主要靶向 posterior 核、后基底内侧核和后基底外侧核，以及内侧杏仁核的 posterodorsal 和 anterodorsal 部。经穹窿（fimbria）走行的纤维在隔区分成前连合穹窿（precommissural fornix）、后连合穹窿（postcommissural fornix）和内侧皮质下丘脑束（medial corticohypothalamic tract）。前连合穹窿纤维投射至外侧隔核腹侧部、伏隔核壳区和核心区内侧、嗅结节、前嗅核、前额叶皮层（边缘前区、边缘下区和前扣带区）、终纹床核（BST）前部（前内侧、前外侧、大细胞和背内侧区）以及内侧视前区广泛区域。后连合穹窿和内侧皮质下丘脑束的纤维向丘脑和下丘脑发出广泛投射：丘脑内主要靶向室旁核前极、未定带核（nucleus reuniens）和 anteromedial 丘脑核腹侧部；下丘脑内覆盖前部、结节部和乳头体部，包括前下丘脑核、视交叉上区、视交叉后区、室下区、外侧下丘脑的 anterodorsal 和 juxtaparaventricular 区，尤其密集投射至室下区和前下丘脑核后部/中央部，但避开室旁核和室周区。结节部主要投射至腹内侧核背内侧和中央部周围的细胞稀疏“壳”区、腹外侧核心区及结节核，并稀疏投射至背内侧核。乳头体部投射至腹侧乳头前核、 posterior 室周核和结节乳头核，但避开背侧乳头前核；在乳头体水平有大量双侧投射至乳头体上核和内侧乳头体腹侧部。

3.2.2 腹侧下托尾侧半部的投射

尾侧腹侧下托的投射模式与头侧部分呈互补关系。在海马内，其投射纤维到达背侧下托并延伸至 ventral 压后区。颞叶皮层和杏仁核的投射较头侧稀疏但更弥散，主要靶向内外嗅皮层、内嗅区和颞联合区，杏仁核内仍主要投射至 posterior 和后基底内侧核及后基底外侧核；当注射位点局限于尾侧三分之一时，杏仁核投射仅见于基底外侧核，且向背侧延伸至尾壳核。前连合穹窿纤维投射至前额叶皮层、伏隔壳区和核心区（更偏吻侧部）、外侧隔核吻侧部（较头侧来源更靠内侧）、BST前部（主要前内侧区）以及视前区；尾侧三分之一注射时几乎无BST和视前区投射。后连合穹窿纤维投射至丘脑的未定带核、室旁核及 anteromedial 核腹侧部（吻侧密集、尾侧稀疏）。下丘脑方面，尾侧腹侧下托显著增加对室周带和外侧下丘脑的投射：大量纤维靶向室旁核和室周核（该区域含神经内分泌运动神经元），并在外侧下丘脑形成宽阔终末场；一些纤维经 ansa peduncularis 延伸至杏仁核。结节部水平，背内侧核接受更密集的输入，腹内侧核背内侧和中央部核心区可见显著投射（头侧来源主要投射至壳区），并观察到少量纤维至弓状核以及正中隆起外层的清晰纤维网络（该层含终止于垂体门脉初级丛的神经纤维）。乳头体部水平，尾侧来源提供双侧密集终末场至背侧乳头前核（头侧来源避开的区域），并同样投射至结节乳头核、腹侧乳头前核和乳头体上核。尤为重要的是，尾侧腹侧下托发出大量纤维至脑干多个位点，包括腹侧被盖区（VTA）、黑质致密部（SNc）、导水管周围灰质（PAG）各柱（背侧、外侧、腹外侧）、中脑网状核、脚桥被盖核（PPN）以及外侧背被盖核和臂旁核。

3.2.3 背侧下托的投射

背侧下托中投射至前下丘脑区域的细胞分支模式相对有限：纤维经穹窿后，前连合穹窿仅稀疏投射至外侧隔核吻侧内侧部；后连合穹窿纤维沿穹窿下行柱走行，仅见零星纤维进入下丘脑相邻区域（包括前下丘脑区），大部分纤维直接延伸至乳头体区，投射至乳头体上核和内侧乳头体背侧部（形成特别密集的终末场），并有一密集终末场位于压后皮层浅层。

讨论总结与研究结论

本研究发现，投射至前下丘脑区域的腹侧下托细胞具有广泛的分支投射模式，同时影响记忆、动机、觉醒、昼夜节律、神经内分泌调节及目标导向行为等多个脑区。研究中使用病毒示踪比传统PHA-L示踪具有更高灵敏度，揭示了尾侧腹侧下托的若干全新投射，如正中隆起外层、室旁核、腹内侧核核心区、背侧乳头前核以及多个脑干位点。通过控制实验排除了来自非下托细胞或逆行转染的假阳性可能。在皮层方面，其投射至内外嗅皮层深层，可能经内嗅区间接影响伏隔核和杏仁核；至前额叶皮层的投射与焦虑反应相关。杏仁核的后基底内侧核等靶点提供了间接影响伏隔核和内侧下丘脑生殖/防御环路的替代通路。伏隔核是重要靶点，该通路参与奖赏、目标导向行为及社会记忆。隔区投射（外侧隔核和BST）参与致焦虑行为、食物摄入调节及情境恐惧表达，并影响下丘脑-垂体-肾上腺轴活动。丘脑的室旁核前部（PVT）通过投射伏隔核调制趋避冲突行为，而未定带核（Re）则与工作记忆和恐惧记忆泛化有关，前内侧丘脑核腹侧部（AMv）接受内侧下丘脑恐惧环路输入并参与捕食者情境恐惧记忆。下丘脑方面，腹侧下托细胞同时投射至内侧下丘脑防御环路和生殖环路，并密集支配室下区（昼夜节律关键区）和结节乳头核（觉醒相关）。外侧下丘脑投射可能靶向orexin能细胞群，影响觉醒和动机。脑干投射（VTA、SNc、PAG、PPN）进一步支持该通路在动机、防御和皮层唤醒中的作用。单神经元水平研究（如Qiu等2024年fMOST重建）也证实海马输出神经元可高度侧支化，与本研究结果一致。

研究结论：腹侧下托前下丘脑投射细胞并非简单的点对点通路，而是一个庞大的侧支化投射系统。这些细胞在驱动恐惧和焦虑反应的同时，可能同步影响记忆、动机、觉醒、昼夜节律、神经内分泌控制以及目标导向行为等多种功能，从而在整合复杂情绪与适应性行为中发挥关键作用。未来需进一步探究这群细胞如何编码空间线索与威胁刺激的效价，以加深对情绪与认知交互机制的理解。