慢性乙型肝炎在研表观遗传沉默疗法CRMA-1001通过靶向DNA甲基化实现病毒DNA转录失活

《Nature Biomedical Engineering》：Development of an investigational epigenetic silencer therapy to transcriptionally inactivate viral DNA in chronic hepatitis B

　　

已批准的慢性乙型肝炎（CHB）疗法很少能实现功能性治愈，因为它们无法永久沉默所有具有转录活性的乙型肝炎病毒（HBV）DNA。CRMA-1001采用一种优化的表观遗传沉默子，通过在附加体和整合的HBV DNA上靶向沉积DNA甲基化来抑制病毒转录。研究人员在HBV小鼠模型中证实，单次剂量的CRMA-1001可使病毒生物标志物降低超过3个log₁₀，这与HBV DNA的从头甲基化相关。三次给药后，治疗后6个月时多达90%的动物乙型肝炎表面抗原（HBsAg）和HBV DNA达到不可检测水平。在非人灵长类动物中，仅在最测试高剂量下，CRMA-1001诱导了短暂的肝脏转氨酶升高。表达和DNA甲基化谱分析显示，在人类基因组中未检测到非预期的靶点。这些发现支持启动CRMA-1001的临床开发，作为一种有潜力使慢性乙型肝炎患者实现功能性治愈的有限疗程治疗。

慢性乙型肝炎（CHB）是一种严重肝脏疾病，全球约2.5亿人受累，每年因肝硬化和肝细胞癌导致超过100万例死亡。现有获批疗法如核苷（酸）类似物（NUCs）虽能有效抑制病毒复制，但极少实现乙型肝炎表面抗原（HBsAg）血清清除，功能性治愈率很低，原因是无法永久沉默肝细胞核内共价闭合环状DNA（cccDNA）和整合HBV DNA（intDNA）这两种转录活性病毒储库。因此，开发能够终止病毒复制、阻断抗原产生并恢复抗病毒免疫的有限疗程策略，具有重大临床意义。研究人员研发了在研表观遗传沉默（ES）疗法CRMA-1001，它是一种由导向RNA（gRNA）和编码表观遗传效应子（EE）融合蛋白的信使RNA（mRNA）共封装于脂质纳米颗粒（LNP）的候选药物。EE蛋白包含催化失活的化脓性链球菌Cas9（dSpCas9）DNA结合域、Krüppel相关蛋白（KRAB）转录抑制域以及DNMT3A催化域和DNMT3L催化样域融合而成的DNA甲基化效应域，可在HBV DNA特定位点沉积DNA甲基化，持久沉默病毒转录而不切割DNA。在HBV小鼠模型中，单次给药产生超过3个log₁₀的病毒生物标志物降低，三次给药后90%动物HBsAg和HBV DNA不可检测；非人灵长类（NHPs）中仅最高剂量出现短暂转氨酶升高；全基因组分析未发现人类基因组可检测的非预期靶点。该研究发表于《Nature Biomedical Engineering》，支持CRMA-1001作为潜在功能性治愈CHB的有限疗程疗法进入临床开发。

研究人员采用的主要技术方法包括：基于HBV数据库（HBVdb）约7,000条A–E基因型全长基因组序列，设计121条覆盖所有病毒开放阅读框（ORFs）的HBV靶向gRNA，并在HepG2-NTCP感染细胞和AAV-HBV小鼠中筛选；利用内源性替代靶点PCSK9在转基因小鼠和NHPs中优化EE蛋白，最终选择EE7000；体内外药效评估使用Tg-HBV小鼠（含整合HBV基因组）、AAV-HBV小鼠（含附加体HBV DNA）、HepG2.2.15细胞、PLC/PRF/5细胞（患者来源整合HBV）、HepG2-hNTCP细胞和原代人肝细胞（PHHs）；特异性评估使用来自3个组织（肝、脾、肾上腺）共9个人类供体的原代细胞（PHHs、人脾内皮细胞HSECs、人肾上腺皮质细胞HAdCCs），结合RNA测序（RNA-seq）和多种DNA甲基化测序方法。

研究结果如下。**HBV靶向gRNA的筛选鉴定与表观沉默效力优化**：从121条gRNA中筛选出HBV-gRNA2，在HepG2.2.15细胞中显示最持久剂量依赖性抗原抑制，其靶点序列在A–H基因型中保守性达94%，且与HBV CpG岛从头甲基化水平相关；利用PCSK9替代靶点优化EE蛋白，EE7000较早期EE4000效力提高约四倍。**CRMA-1001在体内和体外持久抑制intDNA转录**：在Tg-HBV小鼠中，单次注射含EE4000的候选药物后，HBsAg和HBV DNA最大降低2.7和2.9个log₁₀，持续至少7个月，最高剂量组98%肝细胞HBcAg染色阴性，并出现乙型肝炎表面抗体（anti-HBs）；优化后的CRMA-1001（含EE7000）在2.0 mg kg^-1剂量下较EE4000在3.0 mg kg^-1时HBsAg降幅多约1.3个log₁₀；在HepG2.2.15和PLC/PRF/5细胞中证实甲基化介导的持久沉默。**CRMA-1001通过有限疗程持久抑制cccDNA**：在HBV感染的HepG2-hNTCP细胞和PHHs中，HBsAg和HBeAg较对照降低98%；分离PHHs的cccDNA检测到CpG甲基化沉积，最高平均甲基化位于CpG岛II；AAV-HBV小鼠单次给药产生剂量依赖性降低，最大平均降幅HBsAg 3.4个log₁₀、HBV DNA 2.3个log₁₀、HBeAg 1.7个log₁₀；每月一次共三次给药后，1.0 mg kg^-1组90%动物HBsAg和HBV DNA低于定量下限（LLOQ）；与恩替卡韦（ETV）联用显示叠加抗病毒作用。**NHPs中的药代动力学、生物分布和安全性**：单次静脉输注2 mg kg^-1 CRMA-1001后，血浆Cmax在输注结束时达到，主要分布于肝脏和脾脏，未检测到生殖细胞分布；重复给药（Q4W×3）最高剂量2 mg kg^-1时观察到短暂、可逆的肝酶（ALT、AST、TBIL）升高，无相关临床或病理改变，评为非不良事件。**高特异性的全基因组图谱**：在3种原代细胞中，RNA-seq筛选出514个差异表达基因（DEGs），两种甲基化测序方法分别鉴定49和65个差异甲基化区域（DMRs），结合计算机模拟预测共提名1,591个区域进行确认性靶向甲基化检测；最终确认4个高甲基化DMRs，全部来自PHHs，与6个基因邻近；这6个基因与352个可检测表达的DEGs无重叠，因此未检出已验证非预期靶点（VUT）。

讨论部分指出，CRMA-1001实现了持续至少6个月的病毒标志物抑制，符合临床功能性治愈标准，其机制是直接使HBV DNA转录来源失活，而非像小干扰RNA（siRNA）或反义寡核苷酸（ASOs）那样仅在药物存续期间起效。尽管HBV基因组平均甲基化水平看似不高，但个别CpG位点的高甲基化足以驱动异染色质形成并导致近完全沉默，这与基因编辑需高编辑率不同。相比基因编辑，ES不依赖DNA双链断裂，避免染色体重排和新型cccDNA变体风险。NHPs中未观察到生殖细胞分布，结合无VUT结果，支持其高特异性和临床前安全性。结论翻译如下：CRMA-1001通过靶向和特异性DNA甲基化直接沉默转录活跃的HBV DNA，实现长达3.7个log₁₀的HBV生物标志物持续降低并抑制病毒复制；同时，CRMA-1001所用的同一EE蛋白在NHPs中单次给药后对内源性基因PCSK9的沉默持续至少2年。这一差异化机制有望通过有限疗程实现持久的病毒控制，使CRMA-1001成为慢性乙型肝炎患者潜在治愈性治疗手段。