删除远端IRF4调控元件抑制炎症诱导的人类调节性T细胞(Treg)命运重编程

《Nature Immunology》：Deletion of a distal IRF4 element prevents inflammation-induced reprogramming of human regulatory T cell fate

　　

调节性T(Treg)细胞在小鼠中可以丧失谱系特性并获得促炎功能，但人类Treg细胞是否同样易受细胞因子驱动的去稳定化影响仍不清楚。在此，研究人员建立了一种人类Treg细胞去稳定化的体外模型，其特征为谱系特异性转录因子FOXP3的沉默、抑制功能的丧失以及促炎活性的获得。单细胞染色质可及性与转录组谱分析揭示，AP-1结合位点处的染色质可及性在全基因组范围内增加，其中包括一个位于IRF4远端、推测为调控元件的区域。在Treg细胞去稳定化过程中，该元件可及性的增加与IRF4表达升高相关，而其切除可赋予细胞对炎症细胞因子诱导重编程的抵抗性。相反，IRF4与BATF的强制共表达可促进Treg细胞去稳定化。这些数据将远端IRF4调控元件确定为一个关键节点，其能够增强AP-1-IRF4协同活性以驱动Treg细胞去稳定化，这对设计更稳定、更有效的Treg细胞疗法具有重要启示意义。

调节性T(Treg)细胞是CD4⁺T细胞的一个特殊亚群，其特征是组成性表达FOXP3，并具备抑制其他免疫细胞活性的能力。Treg细胞通过多种机制在外周免疫耐受中发挥主导作用，包括抑制抗原呈递、竞争T细胞生长因子、转化代谢产物、促进组织修复以及诱导邻近细胞产生耐受性活性。FOXP3突变导致Treg细胞分化障碍，进而在小鼠和人类中引发系统性免疫失调，这充分说明了Treg细胞功能障碍的严重后果。增强或输注Treg细胞已在多种移植和自身免疫病临床前模型中显示出显著疗效，推动了以Treg细胞增强策略促进免疫耐受的临床转化研究。然而，谱系示踪研究表明，小鼠Treg细胞在慢性炎症环境中可发生表观遗传重编程，所产生的ex-Foxp3细胞抑制活性降低，并获得促炎和细胞毒性功能。有证据提示人类Treg细胞在慢性炎症中同样可能丧失谱系特性，但Treg细胞去稳定化的分子机制尚不清楚。

Treg细胞身份依赖于独特的表观遗传景观，该景观以数百个差异甲基化区域为标志，引导Treg细胞特异性的转录程序。例如，FOXP3保守非编码序列(CNS)2处的Treg细胞特异性DNA去甲基化使内含增强子能够驱动FOXP3的组成性表达，该区域被恰当地命名为Treg特异性去甲基化区域(TSDR)，被广泛认为是Treg细胞谱系定向最可靠的指示标志。虽然胸腺Treg细胞发育过程中表观遗传印记的逐步形成已被描绘，但外周Treg细胞表观基因组的维持仍知之甚少。特别是，多种转录因子(TF)已被报道可增强或削弱Treg细胞身份，基因调控网络失调与表观遗传重编程之间在Treg细胞命运决定中的相互作用需要更深入的研究。在此，研究人员提出了一个炎症细胞因子驱动的人类Treg细胞不稳定性的体外模型，该模型实现了人类Treg细胞谱系维持的分子解析，并推动了保持Treg细胞身份和功能的细胞工程策略的开发。

**体外人类Treg细胞不稳定性模型的建立**

为研究人类Treg细胞是否易受失去谱系身份的影响，研究人员通过荧光激活细胞分选(FACS)分离CD4⁺CD25⁺CD127^lo/?原代人类Treg细胞，并在存在或缺乏促炎细胞因子IL-6、IL-1β和IL-23的条件下进行重复的体外CD3/CD28刺激循环。结果显示，在持续炎症细胞因子暴露下，Treg细胞逐渐下调FOXP3和HELIOS，且FOXP3^?HELIOS^?细胞的比例随细胞因子浓度在50倍范围内呈梯度增加。TSDR焦磷酸测序显示，FOXP3^?HELIOS^?细胞在该区域出现部分但不完全的再甲基化，提示这些细胞正处于细胞状态转变过程中，而非来源于Tconv细胞污染。功能上，细胞因子暴露的Treg细胞表现出体外抑制活性降低、扩增增加，并获得IFN-γ、TNF和IL-17A的产生能力，证明人类Treg细胞在炎症细胞因子存在下反复TCR刺激后可丧失谱系身份并出现功能障碍。

**Treg细胞去稳定化的分子标志**

利用单细胞多组学技术，研究人员对来自3名无关正常供体的原代人类Treg细胞在去稳定化过程中第16天和第25天的核转录组及染色质可及性进行了同步分析。通过加权最近邻(WNN)均匀流形近似与投影(UMAP)聚类鉴定出10个细胞簇。稳定Treg细胞簇(静息Treg、效应Treg、TNFR2高表达Treg)高表达FOXP3、IKZF2、CD27、CD25、CTLA4、ICOS和TIGIT；而去稳定化Treg细胞簇(循环Treg、细胞毒性Treg、炎症Treg)则下调FOXP3和HELIOS并上调促炎细胞因子和/或细胞毒性基因。染色质可及性分析显示，FOXP3转录下调与CNS2处染色质可及性丧失相匹配，而IFNG和GZMB位点可及性增加与其转录上调相关联。去稳定化Treg细胞表现出稳定的Treg细胞开放染色质区域(OCR)可及性显著降低，并获得了正常Treg细胞中不可及的OCR，其中一部分OCR是去稳定化Treg细胞所特有的，表明其在表观遗传上仍区别于Tconv细胞。

**(ex)Treg细胞中IRF4位点的染色质改变**

为鉴定驱动Treg细胞命运转变的关键因子，研究人员对稳定和去稳定化Treg细胞进行了TF基序富集分析。去稳定化Treg细胞中FOXP3和E-box基序相对耗竭，而AP-1、RUNX、ETS和IRF4基序显著富集。对IRF4位点的检查发现，去稳定化过程中内含子6内的近端OCR(OCRprox)染色质可及性逐渐丧失，而转录起始位点下游+40 kb处的远端OCR(OCRdist)可及性则相应增加。Peak-基因连锁分析显示OCRdist可及性与IRF4转录本计数正相关，启动子捕获Hi-C数据也证实OCRdist与IRF4启动子存在强物理关联。通过单独的细胞因子处理实验，研究人员发现IL-23是驱动IRF4位点及全基因组染色质可及性变化的主要细胞因子，且OCRprox与OCRdist间存在负相关。

**IRF4 OCRdist对Treg去稳定化的必要性**

研究人员设计了配对单向导RNA(sgRNA)以介导CRISPR–Cas9对OCRprox或OCRdist的切除。虽然OCRprox或OCRdist缺失均不改变HELIOS⁺稳定细胞中的IRF4表达，但OCRdist切除显著降低了FOXP3^?HELIOS^?去稳定化细胞中IRF4的诱导水平。OCRprox切除轻度加剧了细胞因子诱导的去稳定化，使FOXP3^?HELIOS^?细胞比例增加30%；而OCRdist切除则使该比例降低85%，并维持了Treg细胞相关标志物CD25、CTLA-4、ICOS和TIGIT的表达，同时使稳定HELIOS⁺细胞中的FOXP3表达升高，表明OCRdist通过调控IRF4表达来控制Treg细胞稳定性。

**IRF4与AP-1协同驱动Treg细胞去稳定化**

OCRdist区域包含33个TF家族结合位点，其中AP-1、ETS和STAT基序位于ATAC-seq峰的中心区域。全基因组分析显示，经典AP-1基序TPA反应元件(TRE)在炎症细胞因子处理的Treg细胞中富集最为显著。进一步将OCRdist分为包含AP-1基序的片段1和包含ETS/STAT基序的片段2，分别切除任一片段均可产生与删除整个OCRdist相似的保护效果。OCRdist中还鉴定出1个AP-1-IRF4复合元件(AICE)、1个干扰素刺激反应元件(ISRE)和5个ETS-IRF4复合元件(EICE)，提示IRF4可能通过与AP-1和ETS因子的合作增强自身表达，形成前馈机制。为验证这一假设，研究人员利用CRISPRa系统在无炎症细胞因子条件下过表达IRF4和AP-1家族成员BATF。单独过表达BATF不改变HELIOS⁺细胞比例，单独过表达IRF4使其可变性下降，而IRF4与BATF双重过表达则持续且显著地降低了HELIOS⁺细胞比例，部分重现了细胞因子驱动的Treg细胞去稳定化表型。

**IRF4 OCRdist缺失保留Treg细胞功能**

鉴于OCRdist缺失能显著维持Treg细胞身份，研究人员评估了其在体外和体内的功能保留效果。在炎症细胞因子暴露25天后，ΔOCRdist Treg细胞在共培养试验中对CD4⁺和CD8⁺应答T细胞增殖的抑制能力显著优于AAVS1编辑的对照Treg细胞。在异种移植物抗宿主病(GvHD)小鼠模型中，研究人员将预先经炎症细胞因子处理16天的AAVS1编辑或ΔOCRdist Treg细胞与供体匹配的外周血单核细胞(PBMC)共注射入NOD.Cg-Prkdc^scid Il2rg^tm1Wjl/SzJ (NSG)小鼠。结果显示，虽然炎症细胞因子预处理损害了AAVS1编辑Treg细胞的保护功能，但ΔOCRdist Treg细胞尽管同样经过炎症细胞因子暴露，其延长小鼠生存的能力与未处理组相当甚至更优，证明OCRdist缺失赋予Treg细胞更强的抗炎性细胞因子诱导去稳定化能力以及更高的体内外抑制效力。

**讨论与结论**

本研究建立了一种细胞因子诱导的人类Treg细胞去稳定化体外模型，揭示了人类Treg细胞在IL-2单独培养条件下具有显著的谱系稳定性，同时也暴露了其在炎症细胞因子暴露下的脆弱性。研究人员发现IRF4基因座的两个非编码区域在Treg细胞命运决定中发挥相反作用，其中OCRdist是炎症驱动Treg细胞去稳定化的关键调控节点。机制上，炎症细胞因子(尤其是IL-23)诱导AP-1上调，引发全基因组染色质改变，包括IRF4 OCRdist的开放，进而增加IRF4表达；IRF4随后与AP-1合作巩固染色质变化并驱动Treg细胞谱系去定向。OCRdist缺失通过限制IRF4表达而保护Treg细胞身份和功能。研究结论指出，靶向破坏IRF4 OCRdist可作为一种策略，整合到工程化Treg细胞疗法设计中，以确保更高的安全性和抑制效力。该体外模型也为未来识别更多调控节点和理解Treg细胞身份维持或解体的基因调控网络奠定了基础。