编辑推荐：
一名患有全面发育迟缓、慢性肾脏病（III期）及肾小管功能障碍的6岁女性患者在美国国立卫生研究院未确诊疾病项目中进行评估。尽管外显子组测序未能作出诊断，但家族全基因组测序揭示了NDUFAF6基因的双等位基因变异，即父源遗传的内含子变异（NM_152416.3:c
一名患有全面发育迟缓、慢性肾脏病（III期）及肾小管功能障碍的6岁女性患者在美国国立卫生研究院未确诊疾病项目中进行评估。尽管外显子组测序未能作出诊断，但家族全基因组测序揭示了NDUFAF6基因的双等位基因变异，即父源遗传的内含子变异（NM_152416.3:c.298–768 T > C）和母源遗传的1.6 kb缺失（NC_000008.11:g.95044573_95046180del，跨越第5外显子）。NDUFAF6通过调控ND1生物合成并促进NDUFS8的整合，在线粒体复合物I（complex I）组装中发挥重要作用。NDUFAF6变异与两种OMIM疾病相关，即范可尼肾小管综合征5型（OMIM #618913）和核基因型线粒体复合物I缺陷17型（OMIM #618239），相关表型包括近端肾小管功能障碍和中枢神经系统退行性病变。本例中的内含子单核苷酸变异（有时称为阿卡迪亚变异）已被报道会导致异常剪接。本病例强调了在制定综合诊断策略时，需考虑采用全基因组测序等综合性测序方法来识别非典型变异。
论文解读文章
研究背景与科学问题
线粒体呼吸链复合物I（NADH:ubiquinone oxidoreductase, complex I）是氧化磷酸化系统中首个酶复合体，负责将电子从还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）传递至辅酶Q10，同时将质子泵入线粒体膜间隙以维持电化学梯度。复合物I功能缺陷是最常见的儿童期呼吸链疾病，约占所有线粒体疾病的30%。编码复合物I组装因子的基因NDUFAF6（曾称C8orf38）通过调控ND1亚基的生物合成并促进NDUFS8亚基的整合，在复合物I早期组装中发挥关键作用。此前研究已发现NDUFAF6纯合变异可导致Leigh综合征（一种进行性神经退行性疾病）或阿卡迪亚人群特有的范可尼肾小管综合征（表现为近端肾小管功能障碍而无神经系统症状）。然而，同时累及神经系统和肾脏系统的混合表型极为罕见，且传统外显子组测序常遗漏非编码区或结构变异。本研究旨在通过全基因组测序结合多层面功能验证，阐明一例同时表现全面发育迟缓和慢性肾脏病的患者的分子病因，并拓展NDUFAF6相关疾病的表型谱。
主要技术方法
研究人员采用以下关键技术：1）临床全基因组测序（由Baylor Genetics完成，对先证者及其父母进行Illumina NovaSeq 6000平台测序，使用Dragen单倍型变异检测系统和Manta结构变异检测器进行变异识别）；2）线粒体呼吸链酶活性测定（对皮肤成纤维细胞匀浆进行分光光度法检测复合物I、II、III、II-III联合、IV及柠檬酸合酶活性）；3）蓝色-native聚丙烯酰胺凝胶电泳结合原位活性染色（观察复合物I组装状态）；4）无标记全细胞蛋白质组学分析（使用OrbiTrap Eclipse质谱仪进行数据非依赖性采集，经Spectronaut软件处理并以MitoCarta3.0数据库注释线粒体蛋白丰度）。
研究结果
3.1 临床报告
女性先证者孕35周5天剖宫产出生，出生体重低于第1百分位，因呼吸窘迫入住新生儿重症监护室29天。3.5个月时出现喂养困难、频繁呕吐，诊断为生长迟缓和胃食管反流，19个月时放置胃造口管后症状改善。14个月时血浆酪氨酸和甲硫氨酸升高提示肝脏疾病，肝活检显示轻度微泡性和大泡性脂肪变性、局灶性肝细胞胞浆嗜酸性增强、散在凋亡小体和轻度窦周纤维化。尿液氨基酸分析显示广泛性氨基酸尿，有机酸分析提示持续性乳酸尿和酮尿。22个月时确诊慢性肾脏病III期（肾小球滤过率<30 mL/min/1.73m2）。13个月时出现颅缝早闭及多种面部畸形特征。脑磁共振成像显示轻度弥漫性脑室增大。发育迟缓于3个月时显现，18.5个月开始行走但精细运动和语言发育落后。2岁2个月时纳入美国国立卫生研究院未确诊疾病项目，检测显示生长分化因子15（GDF15）水平达4658 pg/mL（正常≤750），血浆乳酸4.2 mmol/L（正常0–2.2），血浆丙酮酸0.23 mmol/L（正常0.08–0.16）。
3.2 遗传学检测
既往检测包括CFTR基因变异 panel、Russell-Silver综合征相关H19和UPD7检测、染色体微阵列分析和线粒体基因组测序均为阴性。临床外显子组测序仅检出SLX4基因两个意义未明变异，但与患者表型不符。最终通过全基因组测序确认NDUFAF6基因复合杂合致病变异：父源遗传的内含子剪接变异c.298–768 T > C（此前在阿卡迪亚患者中报道为致病性），以及母源遗传的1.6 kb缺失（g.95044573_95046180del），该缺失涵盖第5外显子，为首次报道的大片段缺失，被判定为可能致病。
3.3 功能性检测
成纤维细胞呼吸链酶活性分析显示复合物I活性显著下降（Z评分?9.5），而复合物II、III、IV活性均正常，符合孤立性复合物I缺陷诊断标准。蓝色-native凝胶电泳结合原位活性染色证实复合物I活性大幅降低，但未观察到低分子量异常条带。复合物I组装实验显示全酶复合体（约1 MDa）明显减少，且未见异常组装中间体，提示早期组装障碍发生在Q模块或ND1模块阶段。无标记蛋白质组学分析共鉴定约7530种蛋白，在患者三次重复实验中均未检测到NDUFAF6肽段，表明该蛋白已降至检测限以下。火山图分析显示所有复合物I亚基丰度均降低，其中NDUFS8、NDUFB8、NDUFA13和NDUFB7下降最为显著。相对复合物丰度（RCA）计算显示复合物I丰度降至对照组的35%，远低于21例正常对照成纤维细胞的87%–114%范围，而其他呼吸链复合物、线粒体核糖体亚基及丙酮酸脱氢酶复合物的RCA均在正常范围内。
讨论与结论
本研究描述了一例携带NDUFAF6复合杂合功能丧失变异的线粒体疾病患者，其临床表型涵盖全面发育迟缓、III期慢性肾病、肝活检异常、GDF15显著升高及代谢性疾病相关实验室指标异常。该病例的关键启示在于：首先，传统外显子组测序未能识别致病性变异，而全基因组测序成功发现了内含子区域和结构变异，凸显了在疑似线粒体疾病诊断中探索非编码区域的必要性。其次，母源遗传的1.6 kb缺失（覆盖第5外显子）为首次报道的NDUFAF6大片段缺失，尽管该基因存在多个不包含第5外显子的异构体，但已知定位于线粒体内膜基质侧的功能性异构体必须包含第5外显子，提示该缺失直接影响线粒体功能。第三，功能性研究证实了孤立性复合物I缺陷：酶活性降低超过10个标准差，蛋白质组学显示复合物I丰度仅为对照组的33%（为本实验室所见最低值），且组装分析提示缺陷发生在ND1模块早期阶段。值得注意的是，尽管生化缺陷极其严重，患者并未表现出暴发性新生儿线粒体疾病，这反映了生化缺陷程度与临床症状之间的复杂关系。第四，该病例的表型介于经典的Leigh综合征（以神经系统受累为主）和阿卡迪亚变异相关的单纯肾小管功能障碍之间，表现为神经和肾脏双重受累的混合表型，进一步证明特定变异组合决定临床结局。研究结论强调：对于不明原因的线粒体疾病患者，应优先考虑全基因组测序以捕获非编码区和结构变异，并结合蛋白质组学等多维度功能验证手段以提高诊断效能。
