《Science of The Total Environment》：Quantification of host-associated fecal markers in the Seven Crater Lakes of San Pablo, Laguna, Philippines through library-independent microbial source tracking
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•检测到来自牛、猪和家禽的多源粪便污染。•Cow-Bac2是所有火山口湖中占主导地位的环境标记物。•标记物水平呈季节性变化，在旱季达到峰值。•环境标记物与生化需氧量（BOD）和总悬浮固体（TSS）呈相关，表明存在畜禽来源的输入。引言获得安全和清洁的淡水对公众健康、生态完整性和
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检测到来自牛、猪和家禽的多源粪便污染。
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Cow-Bac2是所有火山口湖中占主导地位的环境标记物。
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标记物水平呈季节性变化，在旱季达到峰值。
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环境标记物与生化需氧量（BOD）和总悬浮固体（TSS）呈相关，表明存在畜禽来源的输入。
引言
获得安全和清洁的淡水对公众健康、生态完整性和可持续发展至关重要。然而，由于粪便污染导致的水质下降仍然是全球淡水湖泊面临的一项持续性挑战，其主要驱动因素包括未经处理的污水排放、农业径流和畜禽养殖活动（Akhtar等人，2021；Ringler等人，2022；世界卫生组织，2022）。
淡水湖泊特别容易受到各种人为活动导致的污染。在菲律宾，拉古纳省圣巴勃罗的七个火山口湖是火山淡水生态系统，支持水产养殖、灌溉、生态旅游和休闲活动，从而对区域社会经济发展作出了重大贡献（Paller等人，2021）。这些湖泊被环境与自然资源部（DENR）归类为C类水体，用于鱼类增殖、灌溉和非接触性休闲。它们由拉古纳湖开发管理局（LLDA）进行积极监测和管理。尽管具有重要的生态和经济价值，但不断加剧的人为压力已导致周围地区的土地利用变化和农业活动加强。
七个火山口湖周围的土地利用以水产养殖、旅游业和农业活动的混合为特征。潘丁湖、扬波湖、桑帕洛克湖和莫希卡普湖是主要的生态旅游目的地，而布诺特湖、卡利巴托湖和帕拉克帕金湖则被大量用于水产养殖和开阔水域捕捞（Brillo，2016，Brillo，2015）。除了水产养殖和旅游业之外，湖泊周围区域还被用于畜禽和家禽生产，包括庭院养牛以及商业养猪和家禽养殖。在2022至2023年期间，拉古纳省仍然是卡拉巴尔宗地区重要的农业省份。2023年，拉古纳省贡献了该地区约23.8%的牛的产量（2072/8886公吨活重）、17.3%的鸡肉产量（53,488/311,359公吨活重）和6.0%的猪肉产量（14,022/233,204公吨活重）。截至2023年1月，拉古纳省还饲养了约37,000头牛、35,000只山羊、19,500头小型农场养殖的猪和133万只鸡（菲律宾统计局，2024）。这些活动可能有助于非点源污染，导致营养物负荷升高和微生物污染加剧，从而加速富营养化并损害水质（Mateo-Sagasta等人，2017；Prüss-Ustün等人，2019）。
拉古纳湖开发管理局（LLDA）此前的水质评估报告显示，粪便大肠菌群浓度存在差异，其中布诺特湖水平最高（），潘丁湖最低（）（Zapanta等人，2008）。尽管粪便大肠菌群可作为污染指标，但它们并不能直接确认病原体的存在。此外，传统的粪便指示菌（FIB），如大肠杆菌和肠球菌，无法识别粪便污染的具体来源，从而限制了针对性缓解策略的实施（Harwood等人，2014；Paruch和Paruch，2022；Sinigalliano等人，2021）。
准确识别来源对于有效管理受到多种污染来源影响的多用途淡水系统中的水资源至关重要。微生物源追踪（MST），特别是无需文库的方法，已成为一种通过遗传标记物识别与宿主相关的粪便污染来源的强大工具。在这些标记物中，拟杆菌属相关目标被广泛使用，因为它们粪便中丰度高、具有宿主特异性和在好氧条件下快速衰减的特性，使其成为近期污染事件可靠的指示物（Bernhard和Field，2000）。此外，线粒体DNA（mtDNA）标记物通过靶向细胞色素b和NADH脱氢酶基因，能够通过对宿主上皮细胞脱落的DNA进行靶向来实现高度特异的宿主归属（Malla和Haramoto，2020）。尽管没有任何MST标记物能完全特异于单一宿主，但这些标记物在区分粪便污染的主要农业来源方面已展现出相当大的实用性。
先前的研究已经证明了宿主相关标记物如Pig-2-Bac（猪）、Cow-Bac2（牛）和Ckmito1（鸡）在区分粪便污染的农业来源方面的有效性（Liang等人，2020；Mieszkin等人，2009；Okabe等人，2007）。然而，MST在热带环境中的应用面临挑战，包括高温、强降雨和增加的微生物多样性，所有这些因素都可能影响标记物的持久性和性能。
在菲律宾，MST在淡水系统中的应用仍然有限。Malajacan等人（2023）在拉古纳湖中评估了猪相关标记物Pig-2-Bac，但报告了家禽相关（ChickenBac和DuckBac）和牛相关（BoBac）标记物检测的不一致性。尽管七个火山口湖具有重要的生态和社会经济价值，但尚无研究利用MST方法全面表征这些系统中粪便污染的空间和季节动态。
本研究通过评估和应用宿主相关MST标记物Pig-2-Bac、Cow-Bac2和Ckmito1来填补这一空白，以检测并量化菲律宾拉古纳省圣巴勃罗七个火山口湖中与猪、牛和鸡相关的粪便污染。具体目标为：（1）评估这些标记物的准确性、灵敏度和特异性；（2）量化旱季和雨季期间标记物浓度的时空变化；（3）评估标记物丰度与关键理化水质参数之间的相关性。研究结果建立了基线数据，以支持基于证据的水质管理，并有助于这些重要淡水生态系统的可持续保护。
章节摘要
研究区域与样品采集
菲律宾拉古纳省圣巴勃罗市的七个火山口湖包括布诺特湖、卡利巴托湖、莫希卡普湖、帕拉克帕金湖、潘丁湖、桑帕洛克湖和扬波湖（图1）。根据圣巴勃罗市综合土地利用计划（CLUP），七个火山口湖内的土地利用以农业区为主，其次是居民定居点、森林植被和商业区。农业活动包括椰子种植园、作物生产、庭院畜禽养殖和商业
DNA提取质量
DNA提取从本研究包含的所有粪便和水样中获得了足够的DNA量。水源DNA提取物的A260/A280比率在1.80至1.92之间，DNA浓度在0.0104至4.72 ng μL?1之间（补充表S1）。粪便DNA提取物同样显示出可接受的纯度（A260/A280 = 1.80–2.00），尽管不同宿主物种的DNA产量存在差异（补充表S1）。这些结果表明提取方案始终如一地产生了
宿主相关MST标记物在热带淡水系统中的性能
Pig-2-Bac、Ckmito1和Cow-Bac2所获得的高准确性、灵敏度和特异性值表明，这些标记物在本研究评估的条件下表现良好，并展示了其在热带淡水系统微生物源追踪（MST）应用中的潜在实用性。然而，由于特异性评估仅限于所测试的可用宿主物种，这些性能估计应谨慎解释。使用更广泛范围进行的进一步验证
结论
本研究证明了宿主相关MST标记物在评估菲律宾圣巴勃罗七个火山口湖中与畜禽相关的粪便污染方面的有效性。所评估的标记物Pig-2-Bac、Ckmito1和Cow-Bac2展现了强大的诊断性能，并能够在热带淡水系统中区分猪、牛和家禽相关的输入。尽管标记物特异性是通过有限范围的宿主组进行评估的，但结果提供了
CRediT作者贡献声明
Mylvie Alexis M. Batican：撰写——审阅与编辑、撰写——原稿、可视化、调查、形式分析、数据管理。Jonah David V. Calayo：撰写——审阅与编辑、撰写——原稿、可视化、调查、数据管理。Kherson P. Gandola：撰写——审阅与编辑、可视化、调查、数据管理。Mae Ashley G. Nacario：撰写——审阅与编辑、监督、方法学、概念化。Laurice Beatrice Raphaelle O. dela Pe?a：
关于生成式人工智能和AI辅助技术在写作过程中使用的声明
在撰写本文期间，作者仅使用生成式人工智能（AI）工具进行语言编辑和语法润色，以改善清晰度和可读性。AI工具未用于数据生成、数据分析、结果解释或科学结论的制定。所有科学内容、分析和解释均由作者开发和核实，作者对完整性
资助
本研究由科学与技术部（DOST）下属的菲律宾工业、能源与新兴技术研究与发展委员会提供资金支持。
利益冲突声明
作者声明不存在任何已知的可能影响本文所述工作的竞争经济利益或个人关系。
致谢
作者感谢拉古纳湖开发管理局（LLDA）为本研究提供的技术支持以及获取对本研究至关重要的水质数据的权限。
Mylvie Alexis M. Batican|Jonah David V. Calayo|Kherson P. Gandola|Mae Ashley G. Nacario|Laurice Beatrice Raphaelle O. dela Pe?a|Windell L. Rivera
