《Signal Transduction and Targeted Therapy》：HSP90 shields ROC1/RBX1 from proteasomal degradation by CHIP E3 ubiquitin ligase to promote lung adenocarcinoma
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Cullins调节因子1（ROC1）又称RING盒蛋白1（RBX1），是最大的多亚基Cullin-RING泛素连接酶（CRL）复合物的核心组分。既往研究表明，ROC1在多种恶性肿瘤中频繁过表达，预示肿瘤分期晚及预后不良。然而，驱动ROC1在癌症中过表达的分
Cullins调节因子1（ROC1）又称RING盒蛋白1（RBX1），是最大的多亚基Cullin-RING泛素连接酶（CRL）复合物的核心组分。既往研究表明，ROC1在多种恶性肿瘤中频繁过表达，预示肿瘤分期晚及预后不良。然而，驱动ROC1在癌症中过表达的分子机制仍然知之甚少。本研究发现，HSP90通过其N端结构域结合ROC1，从而促进ROC1蛋白稳定化。使用HSP90 N端抑制剂（而非C端抑制剂）可加速ROC1去稳定化，其机制是促进ROC1泛素化及随后由CHIP E3连接酶介导的降解。CHIP通过其卷曲螺旋（CC）结构域特异性结合ROC1，促进ROC1第26位赖氨酸（K26）残基发生K48连接泛素介导的降解。确实，敲除CHIP可显著阻断HSP90失活诱导的ROC1减少。功能探索揭示，HSP90抑制通过降低ROC1丰度显著抑制肺腺癌（LUAD）细胞生长。临床上，HSP90β和ROC1在LUAD样本中均过表达，两者表达呈正相关，并预示LUAD患者预后不良。LUAD类器官分析显示，HSP90阻断促进ROC1去稳定化并抑制类器官细胞生长。综上所述，本研究结果揭示了ROC1在恶性肿瘤中的调控机制，并提出HSP90促进肺肿瘤发生的致癌作用新机制。
# HSP90-ROC1-CHIP调控轴：肺腺癌发生发展中的新机制解读
## 一、研究背景与科学问题
蛋白泛素化是一种可逆的翻译后修饰，通过动态调控数千种细胞蛋白的稳定性、定位及生物学活性，在人类癌症的发生、发展和恶性进程中发挥不可或缺的调控作用。Cullin-RING泛素连接酶（CRL）是最大的多亚基E3泛素连接酶复合物家族，通过介导大量底物蛋白的蛋白酶体降解，调控细胞周期转换、DNA损伤修复及信号转导等核心生物学事件。ROC1（又称RBX1）是CRL复合物的关键组分之一，能够选择性结合除Cullin5以外的绝大多数Cullin家族成员（Cullin1、2、3、4a、4b和7），并与不同的底物招募接头蛋白协作组装具有催化活性的完整CRL E3连接酶，最终促进泛素从E2泛素结合酶转移至特异性底物以供蛋白酶体降解。大量研究已证实，ROC1在多种人类恶性肿瘤中表达显著上调，其高蛋白水平与晚期病理肿瘤分期、侵袭性转移及不良临床预后正相关。靶向ROC1在多肿瘤模型中表现出显著的抗癌效果：敲低ROC1可破坏CRL复合物的结构完整性和酶活性，导致多种肿瘤抑制蛋白（如p21、p27等）在细胞内大量积累，并诱导多种细胞死亡模式。
然而，该领域的关键问题——ROC1在人类癌症中过表达的分子机制——在很大程度上仍未阐明。热休克蛋白90（HSP90）是一种进化上保守的关键分子伴侣，通过维持客户蛋白的功能和结构完整性在蛋白质稳态中发挥重要作用。两个主要的细胞质HSP90亚型——HSP90α（由HSP90AA1编码）和HSP90β（由HSP90AB1转录）——在细胞质中发挥重叠但部分不同的伴侣活性。HSP90的伴侣功能被认为是肿瘤发生和进展所必需的，部分通过与多种致癌客户蛋白（如HER2、AKT、cRaf和HIF1α）结合并调控其成熟和稳定化来实现。过去几十年中，靶向HSP90的小分子抑制剂（如17-AAG、STA-9090和TAS-116）不断被开发并展现出卓越的抗肿瘤效果，多种HSP90小分子抑制剂已进入治疗实体瘤和血液恶性肿瘤的Ⅲ期临床试验。因此，系统鉴定HSP90的新客户蛋白并进一步阐明其促癌机制，对于开发更精准有效的抗癌治疗策略至关重要。
值得注意的是，CHIP（又称STUB1）是一种含U-box结构域的E3泛素连接酶，调控多种HSP90结合客户蛋白的周转和稳定性。但目前尚未见关于CHIP与CRL泛素连接酶复合物（特别是核心催化亚基ROC1）之间物理相互作用和调控关系的报道，这极大限制了对泛素-蛋白酶体系统（UPS）介导的肺腺癌肿瘤调控的全面理解。基于上述背景，本研究旨在阐明驱动ROC1在恶性肿瘤中过表达的上游调控机制，并探索HSP90-CHIP-ROC1调控轴在肺腺癌进展中的功能意义。
## 二、研究设计与关键技术方法
研究人员综合运用多种技术手段开展研究。首先采用免疫共沉淀（Co-IP）联合质谱（mass spectrometry）策略系统筛选ROC1结合蛋白（以A549和H1299等肺腺癌细胞系为模型）。随后利用免疫印迹（Western blot）、免疫荧光（IF）和结构域截短突变体分析验证HSP90与ROC1的相互作用及结合结构域。为研究HSP90对ROC1稳定性的调控，使用HSP90 N端抑制剂（17-AAG、STA-9090、AUY-922）和C端抑制剂，并结合CRISPR-Cas9基因敲除技术。为鉴定ROC1特异性E3泛素连接酶，采用E3-底物相互作用计算预测模型筛选候选E3，通过siRNA/sgRNA逐一敲低验证，并结合CHX（放线菌酮）追踪实验和泛素化分析明确CHIP对ROC1降解的调控。此外，利用细胞增殖实验（ATPlite、CCK8）、克隆形成实验、流式细胞周期分析、异种移植瘤模型（BALB/c裸鼠）、临床组织芯片免疫组化（IHC）以及患者来源类器官（PDO）模型（样本来自复旦大学附属肿瘤医院）等，全面验证HSP90-ROC1轴在体内外的功能和临床相关性。
## 三、主要研究结果
### HSP90与ROC1相互作用
通过质谱分析，除已知的Cullin家族蛋白外，HSP90α和HSP90β也被捕获为ROC1结合蛋白。内源性Co-IP和外源性过表达实验均证实ROC1与HSP90α/β存在特异性结合，免疫荧光显示二者在细胞质中共定位。结构域映射实验表明，HSP90α和HSP90β的N端结构域介导与ROC1的相互作用。
### HSP90保护ROC1免于泛素化介导的降解
HSP90 N端抑制剂以剂量依赖性方式显著降低ROC1蛋白水平，而对ROC2（另一含RING结构域的蛋白）影响甚微；C端抑制剂则无此效果。CRISPR-Cas9敲低HSP90AB1（而非HSP90AA1）显著降低ROC1蛋白水平，表明HSP90β在维持ROC1蛋白稳定性中发挥关键作用。蛋白酶体抑制剂MG132可完全逆转HSP90抑制剂诱导的ROC1下调，而溶酶体抑制剂CQ无此效果。泛素化实验证实，HSP90抑制显著增加ROC1的多聚泛素化水平（特别是K48连接的多聚泛素链）。
### CHIP E3泛素连接酶结合并介导ROC1降解
通过E3-底物相互作用预测模型和敲低筛选，CHIP被鉴定为调控ROC1泛素化降解的特异性E3连接酶。CHIP的卷曲螺旋（CC）结构域介导其与ROC1的物理相互作用。野生型CHIP以剂量依赖性方式促进ROC1降解，而E3连接酶活性缺失突变体（H260Q、P269A）及HSP70结合缺陷突变体（K30A）均丧失此功能。CHIP敲除显著延长ROC1蛋白半衰期。亚细胞分离实验表明，CHIP介导的ROC1降解发生于细胞质中。
### CHIP促进ROC1在K26位点的K48连接泛素化
研究人员构建了ROC1的6个赖氨酸（K）到精氨酸（R）点突变体，发现仅K26R突变体能够逃避CHIP介导的降解。进一步泛素化实验证实，CHIP催化ROC1在K26位点（K26）组装K48连接的多聚泛素链。此外，HSP90抑制（药理学抑制或siRNA沉默）显著增强ROC1与CHIP的结合，且CHIP缺失可完全阻断HSP90抑制剂诱导的ROC1降解。
### HSP90抑制在体内外抑制ROC1调控的下游信号
HSP90抑制剂处理显著抑制LUAD细胞增殖并诱导G2期细胞周期阻滞，同时降低ROC1调控的Cullin家族成员（Cullin1、2、3、4a、4b）蛋白水平，并导致肿瘤抑制蛋白p21和p27积累。异种移植瘤模型中，STA-9090（25 mg/kg）显著抑制A549细胞体内肿瘤生长，降低肿瘤组织中ROC1和Cullin1-4b表达，且未观察到明显毒性。ROC1敲低可显著减弱STA-9090对细胞增殖的抑制率，证明ROC1是HSP90介导促癌信号的关键下游效应分子。
### 人LUAD组织中HSP90β与ROC1表达相关性分析
在16对LUAD肿瘤及癌旁组织的免疫印迹分析和75例肿瘤（69例配对癌旁）的组织芯片IHC染色中，HSP90β和ROC1均在肿瘤组织中显著过表达。TCGA数据库分析显示HSP90AB1转录水平在LUAD中显著升高，Kaplan-Meier生存分析表明高表达HSP90β或ROC1的LUAD患者总生存率显著降低（P＝0.009和P＝0.018）。Pearson相关分析显示HSP90β与ROC1蛋白表达在LUAD中显著正相关（P＝0.015）。
### HSP90抑制降低人肺腺癌类器官中ROC1表达
在患者来源LUAD类器官模型中，HSP90失活显著降低ROC1表达并积累p21，同时类器官活力明显下降，形态学观察证实生长受到显著抑制。
## 四、讨论与结论
本研究首次揭示了HSP90伴侣蛋白与CHIP E3泛素连接酶协同调控ROC1蛋白稳定性的分子机制：在肺腺癌细胞中，HSP90通过其N端结构域结合ROC1，保护其免受CHIP介导的K48连接泛素化依赖性蛋白酶体降解。当HSP90被药理学抑制时，ROC1与CHIP的相互作用增强，ROC1在K26位点被CHIP催化发生K48连接多聚泛素化，进而被蛋白酶体降解，导致p21和p27等肿瘤抑制蛋白积累及细胞周期阻滞。临床样本分析证实HSP90β与ROC1表达正相关且均预示LUAD患者不良预后。该研究不仅阐明了ROC1在恶性肿瘤中过表达的上游调控机制，为理解HSP90促癌作用提供了新视角，更提出靶向HSP90-ROC1相互作用这一底物特异性干预策略可能是治疗肺腺癌的高效低毒新方案，为未来肺癌治疗药物开发提供了有前景的可成药靶点。
