《Nature Communications》：Combinatorial mechanisms specify cellular location and neurotransmitter identity during planarian neurogenesis
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再生性神经发生能够在损伤后以正确的类型和位置驱动神经元替代，从而忠实地恢复形态与功能。然而，驱动成功再生性神经发生的遗传机制，包括产生神经元多样性和空间组织的机制，至今仍知之甚少。涡虫是具有卓越脑再生能力的扁形动物，其全身多能干细胞在损伤后通过神经发生重新形成
再生性神经发生能够在损伤后以正确的类型和位置驱动神经元替代，从而忠实地恢复形态与功能。然而，驱动成功再生性神经发生的遗传机制，包括产生神经元多样性和空间组织的机制，至今仍知之甚少。涡虫是具有卓越脑再生能力的扁形动物，其全身多能干细胞在损伤后通过神经发生重新形成复杂的神经系统。在此，研究人员聚焦于多巴胺能神经元身份，并报道了在涡虫中枢神经系统（central nervous system, CNS）、外周神经系统（peripheral nervous system, PNS）和咽神经系统（pharyngeal nervous system, PhNS）中对该神经元类型的再生性神经发生至关重要的因子的发现。包括irx4/6、fli1-2、soxB1-2、foxA、app-L1和lmo1/3-1在内的多个不同基因，在神经系统的不同区域促进多巴胺能神经元的再生与维持。研究结果表明，涡虫神经发生需要协调启动神经递质选择和区域位置的因子。该研究提示，细胞类型和空间身份的组合性指令可能改善旨在局部损伤后精确替代神经元的外源性干细胞疗法。
论文解读：涡虫神经发生中多巴胺能神经元身份与位置确定的组合机制
一、研究背景与拟解决的科学问题
发育性神经发生是指神经元在可预测的时间和特定的微环境中从祖细胞中诞生的过程。相比之下，再生性神经发生发生在正常的发育时间框架之外，新生细胞与存活的旁观细胞在损伤部位以不可预测的方式混杂在一起。损伤修复还要求产生数量与类型均不可预测的神经元，理想的结果是对于特定位置，能够忠实地再现正确的细胞类型和比例。虽然某些生物可以通过局部祖细胞池进行再生性神经发生，但在包括人类在内的许多动物中，中枢神经系统（central nervous system, CNS）的再生性神经发生仅偶发于少数几个脑区。再生医学中的转化研究已致力于弥补这一不足，然而，诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cell, iPSC）来源的神经元（如人类中脑多巴胺能神经元）在移植后仍面临诸多挑战。移植后6至12周，仅有不足30%的移植物呈现成熟多巴胺能神经元的特征，并且已观察到移植物细胞发生迁移。近年来，多巴胺细胞疗法已进入I/II期临床试验，但仍需进一步研究以确保长期疗效。因此，理解如何诱导再生性神经发生，或如何改善外源细胞向疾病或损伤特异性结局的整合，有望彻底改变神经退行性疾病及其他CNS损伤的治疗策略。
涡虫以其再生能力著称，几乎在任意损伤后都能从头再生大脑。在涡虫中，多能干细胞响应损伤而分裂并产生后代。关键在于，神经元以正确的数量、多样性、分布模式和连接方式被生成，以恢复功能。由于涡虫缺乏驻留祖细胞仍能精确再生神经元，这引出了诸多重要问题：多能干细胞如何以正确的数量、类型和比例建立神经元？在再生性神经发生过程中，神经元细胞身份和位置是如何被指定的？这些问题的解答具有重要价值，因为基于人类干细胞的疗法很可能依赖外源干细胞，要求这些细胞能够准确分化、成熟、定位并建立连接，以恢复受损神经组织的功能。此外，涡虫神经系统在空间和细胞类型上具有高度复杂性，适合作为研究模型。涡虫神经系统由三部分构成：包括脑和腹神经索的CNS、外周神经系统（peripheral nervous system, PNS）以及咽神经系统（pharyngeal nervous system, PhNS）。该神经系统包含胶质细胞和至少70种神经元细胞类型，每种细胞类型以可预测的比例和位置存在。此前已鉴定出若干神经元和胶质细胞身份的调节因子，例如pitx和lhx1/5-1指导血清素能神经元的终末分化，soxB1-2、coe和sim在神经元特化中发挥广泛作用。然而，对于涡虫神经系统中任何细胞类型，从多能干细胞到成熟神经元的完整通路尚未被阐明。
二、研究内容与技术方法概述
为更好地理解涡虫再生性神经发生的机制，研究人员聚焦于一种保守的细胞类型——多巴胺能神经元。在多细胞动物中，多巴胺通过保守的酶酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase, TH）和氨基酸脱羧酶（amino acid decarboxylase, AADC）合成。在涡虫中，TH和AADCa标记了一组可量化且存在于神经系统各区域的神经元亚群。此外，TH+神经元在涡虫及其他动物的运动功能中具有重要作用。从转化医学角度看，多巴胺能神经元的丧失是帕金森病的核心病理特征，并涉及其他神经退行性疾病。因此，多巴胺能神经元既是实验上易于处理的体系，又具有深层保守性，是研究再生背景下神经发生机制的理想切入点。
研究人员对涡虫（Schmidtea mediterranea，CIW4株）开展了系统的反向遗传学筛选。首先，通过分析已有的单细胞转录组数据，鉴定出74个在富含TH、AADC和DAT转录本的细胞簇中高度富集的候选基因。研究人员成功克隆了其中73个转录本，并检测了64个基因的表达模式，确认其均在CNS、PNS和/或PhNS中表达。通过荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization, FISH）与TH共表达分析，验证了这些基因与多巴胺能神经元的相关性。随后，研究人员通过喂食双链RNA（double stranded RNA, dsRNA）进行RNA干扰（RNA interference, RNAi）敲降，结合再生模型，系统评估了这些基因对多巴胺能神经元再生的影响。研究还结合了高效液相色谱（high performance liquid chromatography, HPLC）检测单胺类神经递质水平，采用F-ara-EdU脉冲追踪结合FISH检测新生神经元，利用TUNEL染色及凋亡抑制（包括bax-1,2 RNAi和M50054药物处理）评估细胞存活，并通过行为学实验（翻正反射和滑行速度）分析多巴胺能神经元的功能。此外，研究人员还进行了批量RNA测序（RNA sequencing, RNA-seq）以解析转录因子网络之间的调控关系。
三、主要研究结果
1. 发现TH+细胞再生所需基因
研究人员首先验证了TH和AADCa作为涡虫多巴胺能神经元标记物的可靠性，并确认了多巴胺转运蛋白（dopamine transporter, DAT；亦称slc6a3）在TH+细胞中始终表达。值得注意的是，研究发现了罕见的TH+/TBH+神经元亚群，并通过HPLC证实TH(RNAi)导致多巴胺和去甲肾上腺素水平显著下降，而TBH(RNAi)仅显著降低去甲肾上腺素水平。基于单细胞转录组数据，研究人员鉴定出74个候选基因，并通过RNAi筛选发现10个基因在神经系统一个或多个区域对多巴胺能神经元的再生和/或维持至关重要。
2. lmo1/3-1和app-L1是CNS中TH+神经元再生所必需的
通过重复筛选并进行FISH定量，研究人员确认了dzank1、gst-2、lmo1/3-1和app-L1四个基因的敲降导致再生脑中TH+细胞数量减少。其中，lmo1/3-1(RNAi)在非损伤条件下也显著减少TH+细胞，而app-L1(RNAi)仅影响再生过程。共表达分析表明，lmo1/3-1和app-L1在脑和PNS中与TH共表达，暗示其可能以细胞自主方式发挥作用。F-ara-EdU脉冲追踪实验显示，两种基因的敲降均导致TH+/F-ara-EdU+双阳性细胞数量减少，表明其参与多巴胺能神经元的诞生。通过bax-1,2(RNAi)抑制细胞凋亡的实验证实，app-L1通过促进现存多巴胺能神经元的存活发挥作用，而lmo1/3-1的作用与细胞死亡无关。此外，lmo1/3-1还影响cpp-1+肽能神经元，而app-L1的作用则相对特异于多巴胺能神经元。
3. FLI和IRX基因是全身TH+细胞所必需的
在初筛中，fli1-2(RNAi)和irx-4/6(RNAi)导致PNS中多巴胺能神经元显著减少。进一步研究表明，fli1-1、fli1-2、irx-like和irx-4/6共同促进外周多巴胺能神经元的维持，其中IRX基因对背部TH+细胞作用更显著，而FLI基因优先影响腹部TH+细胞。在脑和咽中，fli1-2和irx-4/6均对多巴胺能神经元的维持至关重要。F-ara-EdU实验表明，这两种基因对于脑和咽中多巴胺能神经元的诞生是必需的。通过bax-1,2(RNAi)抑制凋亡的实验揭示，fli1-2和irx-4/6在脑和PNS中同时促进细胞诞生和存活，但在咽中仅参与细胞诞生。
4. TH+神经元在涡虫运动中的功能
行为学实验表明，TH(RNAi)动物在再生后翻正反射时间显著延长，而TBH(RNAi)无此效应，证实该行为与TH在多巴胺合成中的作用相关。lmo1/3-1、app-L1、irx-4/6和fli1-2的敲降均重现了这一表型，其中fli1-2(RNAi)影响最为严重。滑行速度实验显示，TH(RNAi)和irx-4/6(RNAi)均导致速度降低。这些结果表明，CNS和PNS中不同的多巴胺能神经元群体控制着涡虫的不同运动行为。
5. soxB1-2和foxA为TH+细胞提供空间定向
研究发现，soxB1-2(RNAi)在再生和维持范式中均显著减少外周TH+和DAT+细胞数量，且soxB1-2仅在外周与TH共表达，体现了其对PNS多巴胺能神经元的位置特异性调控。另一方面，foxA在咽部表达，foxA(RNAi)导致再生咽中TH+细胞显著减少，且仅与咽部TH+细胞共表达，表明foxA特异性调控PhNS多巴胺能神经元的命运。
6. 神经元身份和位置相互依赖地决定
批量RNA-seq分析显示，soxB1-2敲降导致大量基因差异表达，而fli1-1;fli1-2或irx-like;irx-4/6双敲降导致较小的差异基因集。TH和DAT在所有敲降条件下均下调。soxB1-2(RNAi)导致irx-like和fli1-2转录本减少，而fli1-1;fli1-2双敲降也导致soxB1-2 mRNA水平降低，揭示了这些转录因子之间的相互调控关系。F-ara-EdU脉冲追踪实验表明，fli1-2、irx-4/6和soxB1-2均在S期后被标记的干细胞中表达，其中fli1-2和irx-4/6在较早期即有表达，而soxB1-2表达较晚。这些数据支持位置和身份在本质上近乎同时被指定，但细胞类型身份驱动因子在区域特异性因子之前短暂出现，从而驱动协同网络。
四、讨论与结论
本研究鉴定出10个在涡虫神经系统不同区域中多巴胺能神经元再生所必需的基因，并深入表征了其中6个基因的功能。研究发现多个关键因子在其他动物中与多巴胺能神经元相关，如FLI同源物在秀丽隐杆线虫中指定多巴胺能神经元，foxA同源物在小鼠模型中影响多巴胺能神经元的诞生、维持和年龄相关退化。此外，哺乳动物同源基因gst、dzank1、lmo3和app在多巴胺能神经元中表达，而IRX家族基因虽与帕金森病相关，但尚未在神经发生层面进行研究。这些发现为在其他物种中探索多巴胺能神经元的生理和命运提供了潜在的靶点。
研究揭示soxB1-2和foxA分别编码PNS和PhNS中多巴胺能神经元的位置信息。秀丽隐杆线虫中foxA的同源基因PHA-4是肠神经系谱的先驱转录因子，而soxB1-2被证实影响多种神经元亚型并可诱导染色质可及性的全局变化。这些结果支持FoxA和SoxB1-2作为涡虫身体不同区域神经元身份的主调控因子的模型。
值得注意的是，研究发现涡虫PNS中存在背部与腹部多巴胺能神经元的差异。irx-like仅在腹部表达，而irx-4/6(RNAi)对背部TH+神经元影响更为严重但重现了TH(RNAi)的滑行减慢表型，提示背部PNS多巴胺能神经元在调节滑行速度中具有功能。涡虫通过骨形态发生蛋白4（bone morphogenetic protein 4, bmp-4）和抗背部化形态发生蛋白（anti-dorsalizing morphogenetic protein, admp）调控背腹轴模式，但该信号轴如何指导外周神经元命运仍有待研究。
关于涡虫神经发生中最核心的谜团——命运特异性转录因子如何在干细胞中初始表达，研究人员提出，神经元的身份和位置在再生过程中近乎同时被指定，细胞类型身份驱动因子略先于区域特异性因子出现，从而启动协同网络。该研究对单个神经元类型在涡虫中的分子解析，为理解多能干细胞如何在缺乏发育脚手架的情况下在体内不同位置采用共同的神经元身份提供了重要基础。
综上所述，本研究鉴定出10个在涡虫神经系统不同区域中多巴胺能神经元再生所必需的基因。该研究对涡虫单一神经元类型达到了前所未有的分子理解水平，开始定义多能干细胞在不同位置获得共同神经元身份的旅程。研究人员得出结论：在缺乏关键发育支架的情况下，组合机制近乎同时地指定再生过程中的神经元身份和位置。这一发现提示，细胞类型和空间身份的组合性指令可能为改善外源性干细胞疗法、实现局部损伤后神经元的精确替代提供新的策略。
