《ANALYTICAL AND BIOANALYTICAL CHEMISTRY》：Automated and online LC-MS/MS for multiplexed monitoring of hormone secretion from murine islets
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朗格汉斯胰岛（islets of Langerhans）是负责分泌激素肽以调节血糖的内分泌微器官。胰岛由五种内分泌细胞类型构成，每种细胞响应胰岛内外信号释放特定的肽类激素。分泌功能障碍与多种代谢性疾病相关；因此，开发能够从时间上分辨多种分泌因子的分析技术，将有
朗格汉斯胰岛（islets of Langerhans）是负责分泌激素肽以调节血糖的内分泌微器官。胰岛由五种内分泌细胞类型构成，每种细胞响应胰岛内外信号释放特定的肽类激素。分泌功能障碍与多种代谢性疾病相关；因此，开发能够从时间上分辨多种分泌因子的分析技术，将有助于理解调控这些细胞健康与异常分泌的因素。为此，研究人员将一套先前为分析人朗格汉斯胰岛激素分泌而开发的在线液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）方法改进用于小鼠胰岛。啮齿类胰岛为许多研究人员提供了易于获取的样本，并能模拟人胰岛的生物学特性；然而，此前尚无关于开发用于测量这些物种多激素样本的分析方法的公开报道。研究人员在微流控系统中对约30个小鼠胰岛进行在线灌流，并将灌流液通过六通阀与1.5 min液相色谱分离相连接。该六通阀实现自动化，从灌流液中获得约2 min的采样周期，从而提供生长抑素、胰高血糖素、胰岛素I和胰岛素II的时间分辨测量。三重四极杆质谱对每种肽的定量限（LOQ）均<0.5 nM。研究人员还进行了小鼠胰岛响应升高葡萄糖以及更复杂的正弦波葡萄糖水平的分泌实验。该方法的自动化、定量能力以及同时识别多种激素物种的能力，预计将为理解调控胰岛激素分泌的因素提供新的见解。
论文解读：基于在线LC-MS/MS的小鼠胰岛多激素分泌动态监测平台
一、研究背景与问题
胰岛（islets of Langerhans）是胰腺的内分泌微器官，通过协调释放多种肽类激素维持正常血糖水平，主要包括由β细胞分泌的胰岛素（insulin）、由α细胞分泌的胰高血糖素（glucagon）以及由δ细胞分泌的生长抑素（somatostatin），此外β细胞还分泌作为胰岛素加工副产物的C肽（C-peptide），常被用作胰岛素分泌的标志物。这些肽类激素的分泌模式受血糖浓度、神经输入等外部因素以及胰岛微环境内自分泌和旁分泌信号等内部因素的共同塑造。然而，这些内部与外部因素之间复杂的相互作用及其对分泌动力学的影响尚未完全阐明。因此，同时监测这些肽类激素的时间分辨释放，对于理解调控胰岛整体分泌谱的调节机制至关重要。
传统上，这些激素主要采用基于抗体的检测方法，如放射免疫分析（radioimmunoassay）和酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay）。尽管灵敏度高，但此类方法存在结构相似肽之间的交叉反应、手工操作步骤繁琐等局限，使得多种激素的多指标检测具有挑战性。液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）提供了一种无需抗体的激素定量替代方法，并在临床应用中广泛用于一种或少数几种血糖调节肽的定量。然而，这些分析通常不用于研究动态变化的时间分辨模式，主要原因是为消除复杂样品基质所需的大量前处理步骤。相比之下，离体系统（如分离胰岛、分散内分泌细胞或胰腺组织切片）可降低样品复杂性，同时仍能提供血糖调节生物学信息。已有少数研究将LC-MS/MS用于定量干细胞来源胰岛或分离人胰岛释放的激素，在这些研究中，少量胰岛被置于微流控装置中，以刺激溶液灌流，并离线收集或在线引入LC-MS/MS分析。这些研究证明了LC-MS/MS能够实现激素分泌动力学的时间谱分析。然而，人胰岛的使用仍存在重大障碍，主要原因是不同供体之间胰岛质量和功能差异较大，且患有代谢疾病的个体来源胰岛往往供应有限。尽管存在一些替代模型，许多研究者仍主要依赖啮齿类动物模型，因其成本低、来源充足，并且能够建立和使用不同糖尿病类型的基因工程模型。然而，前述分析平台并非为啮齿类动物开发，因此需要对其进行分析平台的改造。尽管已有许多针对啮齿类胰岛的肽组学和蛋白质组学分析报道，但据研究人员所知，此前尚无使用质谱同时定量活体啮齿类胰岛分泌的多种激素并进行时间分辨测量的报道。为此，研究人员开发了一种适用于小鼠胰岛的定量肽激素监测分析平台，采样频率为2 min，并考察了30个小鼠胰岛在阶跃和更复杂葡萄糖浓度变化下分泌的血糖调节激素。
二、关键技术与方法
研究人员采用经改造的微流控芯片与在线LC-MS/MS系统耦合。微流控装置由硼硅酸盐玻璃经光刻和湿法化学刻蚀制成，通道尺寸为200 μm×50 μm，胰岛室容积约1 μL。实验中，约30个小鼠胰岛（取自25–40 g雄性CD-1小鼠，经胶原酶P消化分离）被装入胰岛室，通过两台注射泵控制灌流液中葡萄糖浓度，总流速维持在1 μL min?1。微流控装置出口与补充溶剂混合后，经六通阀连接至2 μL定量环，阀切换由自动进样器触发，实现每1.9 min一次的样品加载与1.5 min的LC分离。质谱采用三重四极杆仪器，以多反应监测（MRM）模式同时监测生长抑素、胰高血糖素、胰岛素I和胰岛素II。校准曲线通过将标准溶液经微流控装置流入系统后测定峰面积构建，各分析物的定量限（LOQ）均<0.5 nM。
三、主要研究结果
（一）LC分离与校准曲线优化
人胰岛素与小鼠胰岛素存在序列差异。小鼠具有两个胰岛素基因，胰岛素II是小鼠中与人类胰岛素对应的直系同源物。两种小鼠胰岛素序列与人胰岛素在四个位置不同：A链的E4D，B链的N3K和T30S为两种小鼠胰岛素共有；此外，胰岛素I具有独特的S9P替换，胰岛素II具有独特的K29M替换。胰高血糖素和生长抑素在人鼠之间同源。研究人员测试了先前为人胰岛素、胰高血糖素、生长抑素和C肽开发的分离方法，但未包括鼠C肽I和II。在优化条件下，四种肽在1.5 min内实现分离，最低分离度为胰高血糖素与胰岛素I之间的0.95，足以满足定量要求。校准曲线显示各肽均呈线性关系，生长抑素y=31.7x+12.1（R2=0.9958），胰高血糖素y=517.7x?765.6（R2=0.9845），胰岛素I y=3945.2x?1316.5（R2=0.9992），胰岛素II y=924.0x?74.5（R2=0.9988）。胰岛素I与胰岛素II之间灵敏度差异约4倍，可能归因于胰岛素II的K29M替换导致电离效率降低。所有数据点的RSD介于3%–23%之间，各分析物LOQ均<0.5 nM。与先前的人胰岛监测方法相比，本方法差异仅在于MRM通道和补充溶剂的使用，证明了该方法的稳健性。
（二）葡萄糖刺激下小鼠激素分泌
研究人员将30个小鼠胰岛暴露于从3 mM升高至10 mM、再返回3 mM的葡萄糖浓度，重复实验四次。结果显示，在灌流开始时胰岛素I和胰岛素II均以低水平检出；葡萄糖从3 mM升至10 mM后，两者分泌迅速显著增加，呈现典型的第1时相释放特征；随后在高糖输送期间胰岛素保持升高，符合第2时相反应；当葡萄糖恢复至3 mM时，胰岛素分泌降至基础水平。整个实验过程中胰岛素I和胰岛素II呈现相似曲线，两者的比例在0.30–0.35之间，与既往报道值一致。胰高血糖素作为胰岛素的拮抗激素，表现出相反趋势：在3 mM葡萄糖时释放最高，葡萄糖升高后迅速下降，恢复3 mM后迅速升高，符合胰岛素与胰高血糖素之间既定的反向调节关系。生长抑素在基础葡萄糖输注和胰岛素第1时相分泌期间波动但水平较低，而在胰岛素第2时相分泌期间（40–55 min）释放增加，这种生长抑素分泌滞后于胰岛素释放的时间偏移与先前观察一致。对照实验表明流量切换本身不影响激素分泌。
进一步降低胰岛数量至15、5和1个，观察系统灵敏度。结果表明，尽管某些注射中肽水平（尤其是生长抑素）低于LOQ，分泌模式仍与30个胰岛相似。随胰岛数量减少，除胰岛素II外其他肽的动态难以辨别。在单胰岛实验中，胰岛素II水平在第2时相分泌期间出现每隔4–6 min的振荡，这与胰岛固有的约5 min振荡周期相符，但LC-MS/MS系统约2 min的采样周期使其难以确认真实振荡。
（三）正弦波葡萄糖输送
研究人员以3 mM至10 mM的阶跃升高为初始刺激，随后葡萄糖浓度以10 mM为中心、2 mM振幅、5 min周期呈正弦波形振荡，共进行五次实验，每次使用30个小鼠胰岛。结果显示，胰岛素I和II在初始葡萄糖升高后均出现快速第1时相；在正弦波葡萄糖输送期间（25–54 min），胰岛素轨迹显示比恒定葡萄糖浓度下更丰富的动力学，第2时相期间胰岛素分泌持续增加，往往超过初始爆发的幅度。这一行为与此前使用微流控电泳竞争免疫分析观察到的结果一致。胰高血糖素和生长抑素的趋势与恒定葡萄糖输送相似：胰高血糖素在升高的葡萄糖水平输送期间下降，生长抑素在胰岛素第2时相分泌期间增加。两者均未观察到明显振荡，可能原因是肽释放量低，或葡萄糖波进入相对较大（1.1 mm直径）胰岛室后被衰减。此外，2 min采样率虽满足奈奎斯特定理检测5 min振荡所需的最小频率，但仅处于捕捉激素动力学的下限，可能导致振荡行为的减弱或丢失。
四、总结与结论
研究人员开发并验证了一套在线LC-MS/MS平台，用于以约2 min时间分辨率解析胰岛的多种激素分泌。该平台能够在不依赖抗体的情况下同时定量胰岛素I、胰岛素II、胰高血糖素和生长抑素，相比传统免疫分析方法是一项显著进步。尽管人和小鼠胰岛在结构和细胞组成上存在差异，该方法成功分辨了物种特异的胰岛素亚型，并捕捉了胰岛生理学的标志性特征，包括双相胰岛素分泌、反向调节的胰高血糖素动力学以及延迟的生长抑素释放。此外，该系统还能够在阶跃和振荡葡萄糖刺激下考察激素反应，揭示了常被低分辨率技术掩盖的协调时间关系。该平台预计将成为研究小鼠胰岛多激素分泌谱的有用工具。
