单细胞RNA测序揭示STXBP1相关疾病模型中神经元类型特异性易损性

《Molecular Psychiatry》：Single cell RNA-sequencing reveals neuron type-specific vulnerabilities in a model of STXBP1-related disorder

　　

STXBP1相关障碍（STXBP1-RD）是一种严重的神经发育障碍，由导致STXBP1单倍剂量不足（haploinsufficiency）的新生（de novo）杂合突变引起。STXBP1-RD以发育迟缓、智力障碍、早发性癫痫和自闭症特征为临床表现。脑电图（EEG）分析提示兴奋/抑制（E/I）失衡。然而，STXBP1在迄今研究的所有神经元类型中普遍表达，目前仍不清楚单倍剂量不足如何导致E/I失衡及STXBP1-RD症状。在本研究中，研究人员利用单细胞RNA测序（single-cell RNA-sequencing, scRNA-seq）表征了Stxbp1单倍剂量不足在一个经过验证的小鼠模型中体感皮层所有脑细胞类型中的效应。研究人员观察到细胞类型的相对丰度正常。最显著的转录组变化发生在GABA能和谷氨酸能神经元中，尤其是Sncg中间神经元和深层锥体神经元。星形胶质细胞尽管不表达STXBP1，却表现出显著变化，提示存在非细胞自主性（non-cell autonomous）反应。差异表达基因在不同神经元类型之间的重叠很少，但富集于突触和翻译相关基因本体（Gene Ontology, GO）条目中。同时，通过嘌呤霉素（puromycin）掺入检测到蛋白质翻译呈强烈的降低趋势。兴奋性神经元比抑制性神经元表现出更明显的突触失调。值得注意的是，神经元转录组变化与此前STXBP1-RD蛋白质组学数据高度重叠，但与其他疾病截然不同。癫痫发作负担在星形胶质细胞和神经元中与翻译相关基因的表达呈负相关。这些发现确定了STXBP1单倍剂量不足的细胞类型特异性易损性，这可能解释STXBP1-RD中的过度兴奋、网络功能障碍和认知缺陷。总体而言，这项研究提供了STXBP1相关疾病转录组变化的细胞分辨率图谱，并提出了潜在的新治疗靶点。

STXBP1相关障碍（STXBP1-RD）是由STXBP1基因新生杂合突变导致的严重神经发育障碍，临床表现为发育迟缓、智力障碍、早发性癫痫和自闭症特征。STXBP1编码MUNC18-1，是突触囊泡SNARE介导融合和致密核心囊泡胞吐的关键调控因子。既往脑电图分析提示兴奋/抑制（E/I）失衡，但STXBP1在各类神经元中广泛表达，单倍剂量不足如何选择性地扰乱神经网络并导致临床症状，一直是未解问题。该研究发表于《Molecular Psychiatry》。研究人员利用经过验证的Stxbp1单倍剂量不足（Stxbp1^+/-）小鼠模型，结合行为学监测，开展了全皮层细胞类型的单细胞转录组分析，以无偏方式解析细胞类型特异性易损性。

在技术方法上，研究人员对7–9周龄Stxbp1^+/-小鼠及野生型同窝对照（每组7只，质控后每组6只）的初级体感皮层（Ssp）组织经FACS去除死细胞后，利用10x Genomics平台进行单细胞RNA测序（scRNA-seq）；采用Conos联合Leiden聚类和Allen小鼠脑图谱参考映射注释细胞类别/类型；通过伪批量（pseudobulk）DESeq2结合RUV校正进行差异表达分析，并用ClueGO进行GO功能注释；采用表面翻译传感（SUnSET）实验和单分子荧光原位杂交（smFISH）验证翻译与基因表达变化；运用高维加权基因共表达网络分析（hdWGCNA）鉴定与癫痫样事件相关的共表达模块；最后与已发表的神经发育障碍/癫痫模型及STXBP1-RD患者诱导多能干细胞（iPSC）来源神经元蛋白质组数据进行超几何重叠分析。

研究结果如下：

**Stxbp1单倍剂量不足不影响主要细胞类型丰度，仅VIP中间神经元呈下降趋势。** 通过质控后的35,441个单细胞转录组进行UMAP和Leiden聚类，研究人员发现Stxbp1^+/-小鼠与野生型小鼠在所有主要细胞类别和神经元类型上均无基因型特异性簇；细胞类别比例无显著改变。在GABA能中间神经元亚型中，VIP神经元比例呈非显著下降趋势（WT 41%；HZ 32%，校正p=0.119），提示细胞身份总体稳定。

**Stxbp1单倍剂量不足改变GABA能、谷氨酸能神经元及星形胶质细胞转录组。** 通过伪批量差异表达分析，研究人员共鉴定出237个差异表达基因（DEGs），其中73个上调和164个下调。星形胶质细胞在绝对数量上拥有最多DEGs，但大多数星形胶质细胞不表达Stxbp1，提示非细胞自主性反应。降采样负担分析显示，GABA能神经元中DEGs比例最高，其次是星形胶质细胞和谷氨酸能神经元。Stxbp1表达在两类神经元中均下降约50%，而少突胶质细胞中Ptpn13显著下调。

**共享通路中的细胞类别特异性基因调控，并伴有翻译降低。** GO功能注释显示，星形胶质细胞DEGs富集于应激、能量消耗和转录/翻译相关通路；GABA能及谷氨酸能神经元DEGs富集于翻译、兴奋性、细胞转运、有氧呼吸和突触功能等通路。尽管两类神经元共享相似GO条目，但条目内DEGs几乎不重叠，提示细胞类别特异的转录响应。SUnSET实验显示，GABA能和谷氨酸能神经元的嘌呤霉素掺入分别平均降低55%和59%，呈强烈的翻译下调趋势。

**Stxbp1单倍剂量不足优先影响深层锥体神经元和Sncg抑制性神经元。** 对单个神经元亚型的降采样负担分析显示，第6层端脑内（L6 IT）和第5/6层近投射（L5/6 NP）谷氨酸能锥体神经元DEGs最多，而L2/3和L4/5 IT神经元几乎不受影响；GABA能亚型中Sncg中间神经元受影响最大，Sst中间神经元除Stxbp1本身外无显著DEGs。smFISH在体外培养皮层神经元中进一步验证了GABA能群体中Stmn1表达呈下降趋势。

**不同神经元类型中Stxbp1单倍剂量不足影响不同通路，且突触基因失调以谷氨酸能神经元更显著。** 功能富集分析显示，突触功能、翻译和细胞内信号转导等通路在多个神经元类型中均富集，但大多数其他改变具有类型特异性。SynGO突触基因注释显示，谷氨酸能神经元的突触基因失调比抑制性神经元更明显；突触前功能、突触代谢和信号传导是共同富集的功能，而突触后基因的广泛失调仅见于锥体神经元。

**神经元类别和星形胶质细胞中共表达基因模块与癫痫样事件相关。** 通过hdWGCNA，研究人员在Stxbp1^+/-小鼠的谷氨酸能神经元、GABA能神经元和星形胶质细胞中分别鉴定出14、11和7个共表达模块。与跳跃事件最强负相关的模块富集翻译相关基因，且该负相关在星形胶质细胞中较弱；星形胶质细胞中与突触传递相关的模块与癫痫负荷正相关。部分模块无已知功能注释，提示可能存在新的癫痫相关基因程序。

**Stxbp1单倍剂量不足转录组变化与其他神经发育障碍不共享，但与患者蛋白质组重叠。** 与Hnrnpu^+/-小鼠、红藻氨酸（kainate）癫痫模型、Dravet、Shank2、Rett等模型以及颞叶癫痫和精神疾病死后脑组织的转录组比较显示，神经元DEGs重叠极低；星形胶质细胞DEGs则与多种脑疾病模型有重叠，提示可能是普遍性稳态反应。值得注意的是，本研究中谷氨酸能神经元的转录组变化与STXBP1-RD患者iPSC来源神经元蛋白质组变化显著重叠，为小鼠模型的临床转化有效性提供了支持。

讨论部分指出，细胞类型组成稳定说明单等位基因失活未引起广泛神经退行性改变；星形胶质细胞的变化提示非细胞自主性稳态反应；数据支持GABA能和谷氨酸能神经元均受累，但深层兴奋性神经元和Sncg中间神经元可能是关键节点。翻译下调可能