睡眠干扰通过NCAM1/FGFR1信号轴调控下丘脑小胶质细胞神经炎症与神经元损伤的机制研究

《Cells》：Bladder Sensory Neurons as Regulators of Neuro-Immune-Urothelial Interactions: From Molecular Mechanisms to Targeted Therapy for Neurogenic Bladder and Interstitial Cystitis/Bladder Pain Syndrome

　　

摘要专业翻译 睡眠干扰（sleep disturbance, SD）是普遍存在的公共卫生问题，与认知缺陷和情绪失调相关，然而SD诱导下丘脑功能障碍的机制仍不完全清楚。本研究发现，两周的SD可诱导显著的下丘脑神经炎症，伴随促炎细胞因子白细胞介素-1β（IL-1β）、白细胞介素-6（IL-6）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）以及趋化因子Ccl2表达升高，同时神经元标志物减少，包括尼氏体（Nissl-body）和NeuN+细胞数量下降。单核RNA测序（single-nucleus RNA sequencing, snRNA-seq）提示抑制性神经元对SD表现出显著的转录响应，包括TNF和IL-17信号等炎症通路以及神经元功能障碍相关转录程序的富集。此外，SD还与小胶质细胞活化及其向疾病相关状态（disease-associated state）的表型转变相关，表现为抗原呈递和促炎能力增强。值得注意的是，细胞间通讯分析鉴定出神经细胞黏附分子1（neural cell adhesion molecule 1, NCAM1）/成纤维细胞生长因子受体1（fibroblast growth factor receptor 1, FGFR1）信号轴是小胶质细胞与其他细胞类型之间串扰的关键介导因子。在BV2细胞中，重组NCAM1以Fgfr1依赖方式减弱脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）诱导的炎症反应。与此一致，体内室旁核（paraventricular nucleus, PVN）靶向Fgfr1敲低可加剧SD相关的小胶质细胞活化、神经炎症和神经元损伤。综上，研究结果阐明了NCAM1/FGFR1轴在减轻SD诱导的下丘脑神经炎症和神经元损伤中的关键保护作用，提示该通路可作为睡眠相关神经功能障碍进一步治疗研究的候选机制。

论文解读文章

一、研究背景与科学问题

睡眠是维持大脑稳态、认知功能和整体健康的基本生物学过程。然而，在现代社会中，生活方式的改变和睡眠相关疾病负担的日益加重，导致睡眠障碍（sleep disturbance, SD）的患病率持续上升，其中以失眠和阻塞性睡眠呼吸暂停最为常见。大量证据表明，SD与心血管健康不良影响、免疫功能改变和认知功能下降等一系列有害后果相关。特别是，睡眠缺失与中枢神经系统（central nervous system, CNS）蛋白质和代谢物清除受损、白细胞介素-1（IL-1）和肿瘤坏死因子（TNF）等促炎细胞因子产生增加以及氧化应激增强有关。这些变化还伴随多个脑区的小胶质细胞活化和神经炎症，这些过程可能促进神经元损伤和功能障碍。尽管如此，SD调节神经免疫和神经元完整性的机制仍不完全清楚。

下丘脑是负责睡眠-觉醒调节、心血管调节、能量稳态和神经内分泌整合的关键脑区，在SD背景下尤为值得关注。越来越多的证据表明神经炎症是SD诱导脑病理学的关键介质。长时间觉醒可激活胶质细胞，尤其是小胶质细胞——CNS的常驻免疫细胞，导致炎症细胞因子和趋化因子的释放。这种神经炎症微环境被认为有助于突触重塑、脑氧化应激、异常蛋白沉积、神经元数量减少和神经元兴奋性改变，这些可能共同导致神经元损伤。虽然先前的研究已显示SD啮齿动物模型大脑中炎症标志物增加，但缺乏对下丘脑SD响应的全面、细胞类型特异性分析。确定哪些神经细胞类型是SD诱导炎症的主要驱动因素和靶标，对于开发靶向干预措施至关重要。

二、研究内容与主要结论

研究人员通过建立SD动物模型，结合单核RNA测序（snRNA-seq）、伪时间轨迹分析、基因集富集分析（GSEA）、细胞间通讯分析以及体外和体内功能验证实验，系统揭示了SD诱导下丘脑神经炎症和神经元损伤的分子机制。研究发现，两周SD可诱导小鼠下丘脑显著的神经炎症反应，伴随IL-1β、IL-6、TNF-α和Ccl2等促炎介质表达升高，以及尼氏体和NeuN⁺神经元数量进行性减少。snRNA-seq分析表明，抑制性神经元（inhibitory neurons, IN）对SD表现出最显著的转录响应，富集了TNF和IL-17信号等促炎通路以及神经元死亡和轴突发生等神经退行性相关程序。同时，SD还诱导小胶质细胞向疾病相关小胶质细胞（disease-associated microglia, DAM）样状态的表型转变，表现为免疫激活和抗原呈递能力增强。机制上，研究人员鉴定出NCAM1/FGFR1信号轴作为小胶质细胞与其他细胞类型之间串扰的关键介导因子。体外实验证明，重组NCAM1以Fgfr1依赖方式抑制LPS诱导的BV2小胶质细胞炎症反应并恢复其稳态表型；体内实验进一步证实，室旁核（PVN）靶向Fgfr1敲低可加剧SD相关的小胶质细胞活化、神经炎症和神经元损伤。该研究首次将NCAM1/FGFR1信号轴与SD诱导的下丘脑损伤联系起来，为睡眠相关神经功能障碍的治疗提供了新的候选靶点。

三、关键技术与方法

研究人员主要采用了以下关键技术方法：一是建立自动化睡眠干扰装置（sleep interruption apparatus, SIA）诱导的SD动物模型，实验对象为8周龄雄性Sprague-Dawley大鼠和C57BL/6J小鼠，大鼠购自北京SPF Biotechnology，小鼠同样购自北京SPF Biotechnology；二是对大鼠下丘脑组织进行单核RNA测序（snRNA-seq），采用10× Genomics Chromium平台，每条件3只大鼠混合为一个文库；三是利用Monocle 2进行伪时间轨迹分析以推断小胶质细胞状态转变；四是采用Seurat包进行差异表达基因（DEGs）鉴定和AddModuleScore基因集评分；五是利用GSEA软件进行基因集富集分析；六是采用CellChat等细胞间通讯分析方法鉴定配体-受体互作；七是使用BV2小胶质细胞系进行体外功能验证，包括重组NCAM1蛋白处理和Fgfr1 shRNA转染敲低；八是采用立体定位注射AAV9-shFgfr1-EGFP至小鼠PVN进行体内基因敲低；九是运用H&E染色、尼氏染色、免疫荧光（IF）染色、Western blotting和RT-qPCR等技术进行组织学和分子生物学验证。

四、研究结果

4.1 SD诱导小鼠下丘脑神经炎症和神经元损伤

研究人员对成年雄性C57BL/6J小鼠实施每日ZT0-ZT12时段、持续两周的轨道转子式SD干预。RT-qPCR结果显示，与对照组相比，SD2W组小鼠下丘脑中IL-1β、IL-6、TNF-α和Ccl2等促炎细胞因子和趋化因子表达显著升高，而SD1W组仅IL-1β升高。尼氏染色显示SD2W组下丘脑尼氏体细胞数量显著减少；NeuN免疫荧光染色证实NeuN⁺神经元数量呈时间依赖性下降；H&E染色显示SD2W组出现核固缩和嗜酸性胞质变性等形态异常细胞增多。这些结果表明SD可诱导小鼠下丘脑神经炎症和进行性神经元损伤。

4.2 snRNA-seq揭示SD诱导下丘脑抑制性神经元促炎反应和功能损伤

研究人员对大鼠下丘脑组织进行snRNA-seq，共获得20,497个细胞核，经质控后保留18,330个高质量细胞核，分为10个转录组学不同的簇，包括兴奋性神经元（EN）、抑制性神经元（IN）、星形胶质细胞、小胶质细胞等。GSEA分析显示，在所有细胞簇中IN对SD表现出最强的转录响应，显著富集TNF信号、IL-17信号、凋亡和神经退行性疾病相关通路。IN进一步重聚类为21个亚簇，其中IN0和IN1在SD组中比例显著降低。IN0亚簇上调多个神经元损伤相关基因（Ubb、Stat3、Nos1ap、Mef2c、Grin2c），GO分析富集轴突发生、神经元死亡和细胞突起组织负调控等通路。IN1亚簇则表现出核散斑和SAGA复合物相关通路显著抑制，提示SD破坏剪接稳态，同时IL-17信号通路显著上调。这些结果提示抑制性神经元是SD诱导下丘脑损伤的主要靶细胞群。

4.3 SD诱导下丘脑小胶质细胞活化并促进促炎表型转变

snRNA-seq差异表达分析显示，SD组小胶质细胞中Cst3、Hexb、Cx3cr1以及DAM相关基因（Trem2、B2m、Itgam）表达升高，而增殖相关基因（Fkbp5、Ccnd3）和Pten表达下调。GO富集分析表明上调基因主要富集于免疫应答激活、神经炎症反应、抗原加工与呈递以及小胶质细胞活化等生物学过程。免疫荧光染色显示SD组小胶质细胞密度增加、分支复杂性降低，符合活化表型。小胶质细胞亚簇分析发现Micro0簇在SD组中比例增加，该簇具有DAM样转录特征，上调C1qc、Trem2、B2m、Csf1r、Cx3cr1等基因，KEGG分析富集溶酶体、吞噬体和抗原加工呈递通路。

4.4 伪时间轨迹揭示小胶质细胞向DAM1样状态转变

研究人员将小胶质细胞分为稳态小胶质细胞、DAM1和DAM2三个功能状态。伪时间轨迹分析显示SD组与对照组存在不同的推断转录轨迹，SD组DAM1评分显著高于对照组，且DAM1标志基因（B2m、Trem2）在SD组表达升高，而DAM2标志基因表达沿伪时间变化甚微。这些结果提示SD与小胶质细胞向DAM1样状态的推断性转变相关。

4.5 NCAM1/FGFR1通路负向调控小胶质细胞炎症

细胞间通讯分析鉴定出NCAM1/FGFR1是小胶质细胞与少突胶质细胞、星形胶质细胞、OPC和神经元之间通讯的突出配体-受体对。虽然SD未显著改变NCAM1/FGFR1互作强度或配体受体表达水平，但snRNA-seq显示FGFR1下游信号分子Dusp6和Ets1在SD组中表达下调。体外实验表明，重组NCAM1可促进BV2细胞中Dusp6和Ets1表达，并显著抑制LPS诱导的IL-1β、TNF-α、IL-6和Ccl2表达升高，同时恢复稳态标志物Tmem119表达并抑制DAM相关基因（Axl、Csf1、B2m）和Stat1的表达。Fgfr1敲低后，NCAM1的抗炎和保护作用被消除，证实NCAM1以Fgfr1依赖方式发挥抗炎功能。

4.6 抑制NCAM1/FGFR1轴加剧小胶质细胞炎症反应和神经元损伤

研究人员通过AAV介导的shRNA在小鼠PVN中敲低Fgfr1，随后实施SD2W干预。结果显示，与shCtrl+SD组相比，shFgfr1+SD组下丘脑形态异常细胞增多、尼氏体细胞减少、NeuN⁺细胞数量下降。小胶质细胞形态分析显示细胞密度和胞体面积增加、突起复杂性和最大分支长度减少，呈现更明显的活化表型。RT-qPCR检测显示shFgfr1+SD组下丘脑中IL-1β、IL-6、TNF-α、IFN-γ等促炎细胞因子，Ccl2、Ccl3、Ccl4、Ccl5、Cxcl1、Cxcl9、Cxcl10、Cxcl11等趋化因子，以及Mmp3、Mmp9、Mmp12等基质金属蛋白酶表达均显著升高。这些结果证实PVN中Fgfr1敲低可加剧SD相关的小胶质细胞活化、神经炎症和神经元损伤。

五、讨论与结论

讨论部分总结： 该研究提示NCAM1/FGFR1通路下游信号改变可能是SD诱导下丘脑损伤的机制之一。研究首次将NCAM1/FGFR1作为SD中候选的神经免疫通讯通路。虽然SD已知影响多个脑区，但该研究仅表征了下丘脑的响应，其他脑区效应有待未来研究。抑制性神经元亚群被鉴定为SD后经历显著转录改变的突出神经元群体，IN0和IN1簇的相对减少提示这些亚群在转录组水平上具有选择性脆弱性。研究人员提出NCAM1/FGFR1轴作为小胶质细胞炎症的稳态制动器，NCAM1作为神经黏附分子介导神经元-小胶质细胞串扰，体外和体内互补证据支持其在SD下丘脑响应中的保护作用。SD与小胶质细胞向DAM1样表型转变相关，这可能是连接SD与下丘脑病理学的关键特征。研究存在以下局限性：snRNA-seq缺乏独立生物学重复；未使用脑电图/肌电图直接监测睡眠结构，轨道旋转范式可能引入应激和运动活动等混杂因素；NCAM1/FGFR1信号转导受损的精确分子机制尚待阐明；仅使用雄性啮齿动物，结果可能不适用于雌性；大鼠用于snRNA-seq发现而小鼠用于功能验证，跨物种数据应视为互补而非直接整合；PVN Fgfr1敲低非细胞类型特异性且在SD前实施，无法确定负责的细胞群体和治疗效果。

研究结论： 这些在雄性动物中的发现提示一种潜在的神经免疫通讯机制，并支持进一步研究NCAM1/FGFR1通路作为睡眠相关神经疾病潜在机制靶点的价值。