《Foods》：Interaction Mechanism of Bovine Myosin Oxidation Inhibition by Epicatechin Gallate: Insights from Molecular Docking and Thermodynamic Analysis
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蛋白质氧化是决定肉品质的关键因素。尽管莲子芯原花青素（LSPC）能够抑制牛肉冷藏期间的蛋白质氧化，但其潜在机制尚不清楚。本研究从分子相互作用的角度，研究了LSPC的主要活性成分表儿茶素没食子酸酯（ECG）对牛肌球蛋白的抗氧化活性及构象影响。研究人员应用等温滴定
蛋白质氧化是决定肉品质的关键因素。尽管莲子芯原花青素（LSPC）能够抑制牛肉冷藏期间的蛋白质氧化，但其潜在机制尚不清楚。本研究从分子相互作用的角度，研究了LSPC的主要活性成分表儿茶素没食子酸酯（ECG）对牛肌球蛋白的抗氧化活性及构象影响。研究人员应用等温滴定量热法（ITC）、分子对接和多光谱分析表征了ECG与肌球蛋白的相互作用，并揭示了肌球蛋白氧化抑制的潜在机制。结果表明，ECG对肌球蛋白构象及相关功能特性表现出双相、剂量依赖性效应。在10–30 μmol/L浓度下，ECG显著增强了肌球蛋白的自由基清除能力，并减轻了氨基酸侧链的氧化损伤。在机制上，ECG通过熵驱动的氢键和疏水相互作用自发结合肌球蛋白，诱导以α-螺旋向β-折叠转变为特征的构象重排，降低表面疏水性，并稳定二级和三级结构，从而抑制肌球蛋白的氧化变性。然而，在40 μmol/L浓度下，ECG仍保留对肌球蛋白的抗氧化能力，但增加了表面疏水性并降低了荧光强度。这些变化进一步加剧了结构紊乱，导致蛋白质聚集和微观结构损伤，最终引起肌球蛋白不稳定。这些发现强调了优化ECG剂量对于其在肉品加工中可靠应用的必要性，并为支持ECG和LSPC作为肉类体系天然抗氧化剂提供了实验证据。
**研究背景与意义**
牛肉是优质膳食蛋白的重要来源，但屠宰后其内源抗氧化系统逐渐降解，在光照和氧合等外在因素触发下，蛋白质氧化持续存在于整个冷藏分销和零售周期。这一过程消耗巯基、生成双酪氨酸，最终导致蛋白质分子交联与聚集，进而引发牛肉变色、汁液流失、质地变硬和必需氨基酸损耗等品质劣变，显著降低消费者购买意愿。肌原纤维蛋白约占肌肉总蛋白的55%，是决定肉制品质地的主要组分，其中肌球蛋白最为丰富，呈Y形且富含巯基，极易被氧化，巯基会转化为二硫键并介导蛋白间交联。因此，抑制肌球蛋白氧化并维持其空间构象稳定是保持冷鲜牛肉品质的关键策略。合成抗氧化剂虽高效稳定，但其潜在健康风险促使研究者寻找天然植物多酚替代物。莲子芯原花青素（LSPC）提取自废弃莲子芯副产物，主要含儿茶素、表儿茶素、表儿茶素没食子酸酯（ECG）等，具有显著成本优势和优良的抗氧化、抗菌特性，已有研究证实其可抑制冷鲜牛肉蛋白氧化并延长冷藏货架期4至8天。然而，LSPC为多组分混合物，与蛋白质的精确分子相互作用难以解析，且以往研究多聚焦热加工，关于低温冷藏条件下LSPC及其主要组分通过多酚-蛋白分子相互作用抑制牛肉蛋白氧化的机制尚不明确。为此，研究人员选取LSPC主要活性成分ECG和牛肌球蛋白作为研究对象，整合傅里叶变换红外光谱（FTIR）、热力学分析和分子对接技术，考察ECG与肌球蛋白间的优势结合力、结合模式和结合位点，阐明ECG抑制肌球蛋白氧化并稳定蛋白构象的潜在机制。该研究不仅拓展了多酚-肉蛋白相互作用的理论框架，也为ECG和LSPC作为天然抗氧化剂在肉类加工中的应用提供了实验依据。
**关键技术方法**
研究人员从冷鲜牛背最长肌中提取肌球蛋白，与0–40 μmol/L ECG于4°C孵育12 h后透析去除游离ECG。采用电子顺磁共振（EPR）和DPPH、羟基自由基、ABTS阳离子自由基清除实验评价抗氧化能力；利用巯基检测试剂盒、邻苯二甲醛（OPA）法和荧光光谱分别测定巯基、自由氨基和双酪氨酸水平；通过圆二色（CD）和FTIR分析二级结构，内源色氨酸荧光及ANS探针评估三级结构；扫描电镜（SEM）观察微观结构；等温滴定量热法（ITC）测定结合参数；并进行AutoDock分子对接模拟。样本来源于河南伊赛牛肉有限公司（焦作）的冷鲜牛背最长肌。数据以平均值±标准差表示，采用单因素方差分析和Duncan多重比较进行统计分析。
**研究结果**
**3.1 ECG对肌球蛋白抗氧化性能的影响**
**3.1.1 ECG-肌球蛋白混合物的氧化稳定性**
EPR光谱显示，对照肌球蛋白在4°C冷藏下产生明显羟基自由基（•OH）信号，而ECG-肌球蛋白混合物的•OH信号强度随ECG浓度增加逐渐减弱，40 μmol/L时几乎不可检测，表明ECG结合可有效清除•OH，提高肌球蛋白的氧化稳定性。
**3.1.2 ECG-肌球蛋白混合物的抗氧化能力**
DPPH、•OH和ABTS阳离子自由基清除率测定结果表明，所有ECG-肌球蛋白混合物的清除率均显著高于纯肌球蛋白对照和相应浓度的ECG对照（p < 0.05），最大增幅分别为8.33%、20.54%和11.23%，证明ECG结合显著增强了肌球蛋白的抗氧化能力。
**3.2 ECG对肌球蛋白氨基酸侧链氧化的影响**
**3.2.1 巯基和自由氨基**
新鲜提取肌球蛋白的巯基含量为130.11 nmol/mg蛋白；对照冷藏12 h后降至116.23 nmol/mg蛋白，损失10.67%。ECG处理组巯基含量显著高于对照且随浓度升高而增加，40 μmol/L时最高（124.95 nmol/mg蛋白）。自由氨基含量也随ECG浓度增加而显著上升，表明ECG有效缓解了肌球蛋白氨基酸侧链的氧化修饰。
**3.2.2 双酪氨酸**
对照组双酪氨酸水平为258.56 A.U.，ECG处理组呈剂量依赖性显著降低，40 μmol/L时最低（231.83 A.U.），证实ECG有效抑制酪氨酸氧化和蛋白交联。
**3.3 ECG对肌球蛋白二级结构的影响**
**3.3.1 圆二色光谱**
CD光谱显示对照组在228 nm处有α-螺旋特征峰；10 μmol/L ECG未引起明显变化，20 μmol/L后峰强逐步降低。定量分析表明α-螺旋比例随ECG浓度增加而下降，10–30 μmol/L时β-折叠含量显著增多，而40 μmol/L时β-折叠骤降，β-转角和无规卷曲升高，表明ECG对二级结构呈双相影响。
**3.3.2 FTIR光谱**
ECG-肌球蛋白混合物未出现新吸收峰，说明相互作用以非共价为主。FTIR中ECG在1675 cm
-1的特征峰红移至1640–1620 cm
-1，1657 cm
-1峰强下降，表明β-折叠增加而α-螺旋减少，与CD结果一致。酰胺II带中肌球蛋白1540 cm
-1峰移至1537 cm
-1，酰胺III带1322 cm
-1峰强减弱，证实ECG酚羟基作为氢键供体参与结合，并伴随疏水相互作用。
**3.4 内源荧光光谱**
10、20、30和40 μmol/L ECG对肌球蛋白的荧光淬灭率分别为3.74%、6.81%、16.71%和33.44%，呈浓度依赖性淬灭。ECG通过疏水作用结合色氨酸和酪氨酸残基，形成基态复合物，导致荧光强度下降；高浓度ECG引起三级结构部分展开，加剧淬灭。
**3.5 表面疏水性**
对照组表面疏水性为999.15 FI/mg蛋白。ECG浓度从0增至30 μmol/L时，表面疏水性显著降至495.08 FI/mg蛋白（降低50.45%），归因于ECG抑制氧化诱导的疏水残基暴露，并通过酚羟基结合占据表面疏水位点、改善蛋白亲水性。而40 μmol/L时表面疏水性回升至615.09 FI/mg蛋白，可能是过量ECG诱导蛋白交联聚集或部分展开暴露内部疏水残基所致。
**3.6 ECG对肌球蛋白微观结构的影响**
SEM观察显示，对照组肌原纤维束排列均匀有序；10和20 μmol/L ECG处理无显著变化；30 μmol/L时排列趋于不规则；40 μmol/L时纤维束出现明显紊乱、聚集和破碎，表明高浓度ECG可触发肌球蛋白交联聚集并破坏微观结构。
**3.7 等温滴定量热法（ITC）**
ITC结果显示ECG与肌球蛋白的结合为吸热过程（ΔH > 0），结合常数Ka =（1.52 ± 0.17）× 10
7 L/mol，结合位点数n = 1.311 ± 0.115，ΔH = 95.99 ± 5.21 kJ/mol，ΔS = 483.83 ± 17.28 J/(mol·K)，ΔG = -38.08 ± 0.34 kJ/mol。该结果表明结合是熵驱动、自发的，疏水作用为主要驱动力。
**3.8 相互作用力分析**
化学力扰动实验显示，随ECG浓度升高，疏水相互作用和氢键逐渐增强，离子键减弱，二硫键无显著变化。200 μmol/L ECG时，疏水作用增加14.13%，氢键增加74.06%，离子键减少81.86%，进一步证实疏水作用和氢键是非共价结合的主要驱动力。
**3.9 分子对接**
同源建模的Ramachandran图显示92.70%的氨基酸残基位于最适区域，模型可靠。分子对接显示ECG嵌入肌球蛋白活性口袋，与Asp89、Ala91、Glu497、Glu500、Tyr164和Cys705形成六个经典氢键，其中与Cys705的巯基形成1.96 ?氢键，可能有助于ECG稳定锚定。此外，还检测到四个共轭相互作用对及与Arg147、Gly119、Met493的碳-氢键。分子对接表明疏水相互作用为主、氢键为辅，与FTIR和化学力分析结果一致。
**总结与讨论**
本研究综合EPR、自由基清除实验、氨基酸侧链氧化指标、多光谱分析、ITC和分子对接等手段，系统揭示了ECG与牛肌球蛋白的相互作用及其对氧化的抑制机制。低浓度（10–30 μmol/L）ECG通过熵驱动的氢键和疏水作用自发结合肌球蛋白，诱导α-螺旋向β-折叠转变，降低表面疏水性，稳定二级和三级结构，从而抑制氧化变性和蛋白聚集。高浓度（40 μmol/L）ECG虽仍具有抗氧化活性，但过度结合会导致结构紊乱、表面疏水性回升和微观结构损伤，最终降低肌球蛋白稳定性。因此，在应用ECG改善肉蛋白结构和功能特性时，优化剂量浓度至关重要。
**研究结论**
本研究证明，在4°C冷藏条件下，10–40 μmol/L ECG能有效抑制牛肌球蛋白氧化，同时对其构象及相关功能特性产生明显的双相和剂量依赖性影响。在低浓度（10–30 μmol/L）下，ECG显著增强ECG-肌球蛋白混合物的自由基清除能力并减轻氨基酸侧链氧化。从分子相互作用角度看，ECG的抗氧化机制涉及熵驱动的氢键和疏水作用，使ECG自发生成与肌球蛋白的结合，促进α-螺旋向β-折叠转变并降低表面疏水性，进而诱导蛋白二级和三级结构重排，抑制肌球蛋白的氧化变性。相比之下，高剂量ECG（40 μmol/L）虽仍具有相当抗氧化活性，但过量ECG加剧二级和三级结构扰动，破坏肌球蛋白微观结构并增加表面疏水性，最终降低其结构稳定性。这些发现阐明了肌球蛋白-多酚体系的相互作用以及ECG抗肌球蛋白氧化的可能机制，表明优化剂量和浓度对于应用ECG改善肉蛋白结构和功能特性至关重要。此外，未来将通过分子动力学模拟进一步验证ECG介导的肌球蛋白构象转变和残基保护效应，并系统探索LSPC其他主要组分对肌球蛋白氧化稳定性、结构特性和功能特性的影响。总之，该工作为蛋白-多酚功能复合物的合理开发提供了可靠的实验证据和理论支持，也为ECG和LSPC在肉类加工及健康肉制品开发中的潜在应用提供了有价值参考。
