漆酶模拟纳米酶（Laccase-like Nanozymes, LLNs）与传感策略的集成用于食品质量与安全监测

《Foods》：Integration of Laccase-like Nanozymes and Sensing Strategies for Food Quality and Safety Monitoring

　　

漆酶模拟纳米酶（LLNs）是一类受天然漆酶启发而发展的功能性纳米材料。凭借其优异的催化性能、结构可调性和卓越的稳定性，LLNs已成为食品质量与安全监测领域极具前景的工具。本综述建立了一个系统的“结构—活性—应用”分析框架，将仿生设计与结构工程策略、活性位点与电子结构及催化微环境的调控，以及最终在食品基质中的分析性能相关联。研究深入探讨了LLNs如何与比色、荧光、电化学及多模式传感平台相集成。此外，重点阐述了其在食品质量监测中的应用，包括生物活性标志物的检测、肉制品新鲜度监测、茶叶真伪鉴别与掺假分析，以及其他质量相关参数的评估。在食品安全方面，特别强调了真菌毒素、农药和抗生素残留以及食品添加剂的灵敏检测。尽管取得了上述进展，但在催化机理与活性位点结构的阐明、标准化评价标准的建立，以及在复杂食品基质中选择性和可靠性的提升方面仍存在挑战。因此，未来研究应聚焦于理性活性位点工程、原位机理表征、标准化性能评估，以及将LLNs与多模式、便携式和智能化传感技术相集成，以推动其在食品实际分析中的应用。

论文主体内容总结

1. 引言

漆酶（benzenediol:oxygen oxidoreductases, EC 1.10.3.2）是一类多铜氧化酶，能够催化酚类底物的氧化。漆酶在催化过程中以分子氧（O₂）作为末端电子受体并将其还原为水，无需外源H₂O₂作为氧化剂，且具有广泛的底物特异性。然而，天然漆酶在实际应用中常受限于对环境条件的敏感性、高昂的生产成本以及回收再利用困难等问题。纳米酶的出现为开发稳健、可规模化且高效的生物催化替代方案开辟了新途径。其中，漆酶模拟纳米酶（LLNs）因能复制天然漆酶的催化功能，同时兼具增强的稳定性、可调活性和易于功能化的优势而备受关注。自2015年首次报道具有漆酶样活性的含铜碳点（Cu-CDs）以来，LLNs家族已迅速扩展至配位聚合物、金属有机框架（MOFs）、单原子纳米酶（SAzymes）及复合纳米材料等。现有关于LLNs的综述主要集中于铜基纳米酶及其在环境和生物医学领域的分析应用，而系统聚焦于铜基和非铜基LLNs在食品质量与安全保障中应用的综述仍然有限。本综述旨在弥合这一空白，系统梳理LLNs的结构、催化性能与食品分析性能之间的关系。

2. LLNs的设计策略与材料类型

2.1. LLNs的设计策略

天然漆酶具有高度有序的多铜中心、精确的配位环境和明确的电子传递路径。其活性位点包含一个I型铜（T1Cu）、一个II型铜（T2Cu）和两个III型铜（T3Cu），其中T2Cu和T3Cu构成三核铜簇（TNC）。催化过程中，底物在T1Cu附近被氧化，电子经Cys–His路径传递至TNC，溶解氧在此被还原为水。基于催化机理，当前LLNs的设计策略可分为仿生设计策略和结构工程设计策略两类。仿生设计策略的核心在于模拟天然漆酶活性中心的微环境，如Cu–N配位、三核铜簇及His–Cys电子传递路径。研究人员已探索了多种仿生配体，包括天然氨基酸、非天然氨基酸、多肽和蛋白质等，用于构建LLNs。此外，含咪唑环的小分子化学物、羧酸类化合物以及含硫配体也被用于模拟T1Cu位点的Cu–S配位。结构工程设计策略则主要依赖合理的结构设计和电子结构调控来优化LLNs的催化性能，包括缺陷工程、电子结构工程、杂原子掺杂和异质结构构建等。缺陷工程特别是氧空位构建，通过调控配位环境、电子密度和表面吸附来增强漆酶样活性。电子结构工程以d带中心理论为指导，优化催化表面上中间体的吸附强度。异质结构构建可诱导内建电场，加速电子迁移并促进催化界面上的氧活化。

2.2. 基于结构特征的材料类型

根据结构特征，已报道的LLNs可分为四大类：配位型、MOF基、单原子基和金属氧化物基LLNs。配位型LLNs利用小分子配体（如核苷酸、氨基酸、多肽和小分子化学物）和大分子配体（如蛋白质、DNA和聚多巴胺）与金属离子配位构建。MOF基LLNs以金属节点作为内在催化位点，有机连接体可被选择或功能化以促进底物吸附并创造漆酶样微环境。单原子基LLNs在合适的载体上具有原子级分散的金属位点，形成几何结构明确的M–N_x位点（如Cu–N₄、Fe–N₄和Pt–N₄），模拟天然漆酶的酶活性中心。金属氧化物基LLNs利用金属氧化物纳米材料的固有性质、丰富的表面化学和混合价态阳离子来模拟天然漆酶。这四类材料各有优劣：配位型结构可调但稳定性可能有限；MOF基具有高比表面积和可设计的孔道但可能存在传质限制；单原子基金属利用率高但制备和表征技术要求高；金属氧化物基合成简单稳定性高但表面异质导致机理阐释困难。

3. 基于LLNs的传感模式

LLNs催化的传感模式可分为比色模式、荧光模式、电化学模式、传感器阵列模式和双/多模式。比色传感是最早且最成熟的模式，通常采用2,4-二氯苯酚（2,4-DP）和4-氨基安替比林（4-AP）的氧化偶联显色体系，生成在510 nm处具有特征吸收峰的红色醌亚胺染料。荧光传感通常利用LLNs催化氧化非荧光底物邻苯二胺（OPD）生成具有约560 nm荧光发射的2,3-二氨基吩嗪（DAP），通过荧光内滤效应（IFE）实现信号转换。电化学传感基于LLNs对供电子分析物（如福美双、愈创木酚、槲皮素等）的催化氧化，将化学氧化转化为可量化的电信号。传感器阵列模式利用多个传感单元与目标分析物之间的差异交叉响应，结合模式识别算法生成独特的指纹信号，实现复杂基质中的定性和半定量分析。双/多模式传感通过集成多种读出方式，增强特异性、可靠性和适用性，降低检测限。

4. LLNs在食品质量与安全传感中的应用

4.1. 食品质量

4.1.1. 生物活性化合物的检测

食品基质富含多种生物活性成分，包括酚类化合物、类黄酮、绿原酸、白藜芦醇、槲皮素和抗坏血酸等。基于不同LLNs对酚类化合物的差异催化活性，研究人员构建了多种比色传感器阵列。例如，利用N掺杂MnO₂纳米花对不同酚类化合物的差异漆酶样活性构建了比色传感器阵列，成功识别和区分了咖啡、茶、洋葱和番石榴中的六种酚类化合物。GA-Cu纳米酶的三通道比色传感器阵列利用反应动力学实现了果汁、啤酒和葡萄酒中酚类化合物的高通量检测。通过集成人工神经网络（ANN）算法，VA-Cu纳米酶六通道传感器阵列在红茶、蜂蜜和葡萄汁等复杂食品基质中实现了盲样中酚类化合物的100%准确识别。此外，双功能Cu-BTC纳米酶具有漆酶/过氧化物酶样活性，通过不同酚类化合物的抑制效应构建了双模式比色/光热传感器阵列，结合ANN算法实现了红茶、咖啡和葡萄酒中十种酚类化合物的智能识别。针对单宁的检测，Fe@CN-20单原子Fe纳米酶和VCo-N-C双金属LLN分别被用于白兰地和茶饮料中单宁的定量检测。基于四种Cu-MOF基LLNs构建的四通道比色传感器阵列实现了食品中五种典型天然生物活性化合物的鉴定。N/Ni单原子纳米酶的电化学生物传感器实现了槲皮素的灵敏检测。CA-Cu纳米酶的四通道传感器阵列结合机器学习算法实现了复杂健康茶中类黄酮的准确识别。CuNi/CoMoO₄和CeO₂基比色平台分别实现了抗坏血酸的定量检测。

4.1.2. 感官缺陷物质

苹果汁和橙汁中高浓度愈创木酚（>2 PPB）会导致异味，过量摄入存在肝肾毒性风险。基于CuN₄-G LLN修饰的电化学传感器实现了愈创木酚在5至50,000 pM范围内的检测，检测限为1.2 pM，并成功应用于被酸土脂环酸芽孢杆菌污染的橙汁样品检测。此外，LLNs还被用于果汁澄清处理。AMP-Cu纳米酶的漆酶样活性在酚类含量降低方面优于天然漆酶，CYP-Mnzyme能够高效降解五种果汁中的儿茶酚衍生物，显著降低浊度。

4.1.3. 食品新鲜度的分类与预测

储存过程中，食品因微生物代谢和氧化反应产生挥发性腐败标志物。MnZn双金属冷适应纳米酶可用于挥发性硫化合物的原位监测和肉类新鲜度评估。将传感技术与智能包装策略相结合，通过抗菌和抗氧化功能为肉类质量的实时监测和主动保鲜提供了有前景的途径。

4.1.4. 基于风味成分传感的茶叶分类与掺假/真伪鉴别

利用LLNs的差异响应和金属离子对其催化活性的调节作用，开发了3通道比色阵列，实现了不同产地茶叶盲样的准确识别。基于两种LLNs（CuNA和NAD-Cu）的比色传感器阵列，利用茶叶酚类化合物与4-AP之间的差异显色反应，结合随机森林（RF）算法实现了六种关键茶酚类化合物的100%准确区分，并成功鉴定了白牡丹茶五个掺假水平（0%、25%、50%、75%和100%），为茶叶掺假鉴定提供了高效、稳定且便捷的方法。

4.2. 食品安全

4.2.1. 真菌毒素检测与消减

基于伏马菌素B₁（FB₁）对Ag₃PO₄纳米颗粒漆酶模拟活性的特异性抑制，建立了FB₁比色传感器，检测限为1.73 μg/L。FeCu纳米酶平台利用脱氧雪腐镰刀菌烯醇诱导的漆酶样活性增强，实现了小麦、麸皮和玉米中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的快速筛查。CuNA@Arg-Ce集成了漆酶样、磷酸酶样和过氧化氢酶样活性，通过自级联一步比色法检测玉米赤霉烯酮（ZEN），检测限为0.157 μg/L。在真菌毒素消减方面，Fe-SAzyme可将黄曲霉毒素B₁（AFB₁）催化转化为毒性较低的黄曲霉毒素Q₁（AFQ₁），并在花生奶、玉米汁、碎玉米和白醋中表现出优异的AFB₁吸附和去除能力。CuTA纳米酶对AFB₁的氧化降解率在9小时内达到78%。EmNF-P对花生油中的AFB₁表现出优异的降解性能，且不损失营养成分和风味成分。

4.2.2. 农药残留

LLNs在农药检测中主要采用五种检测机制：LLN活性调节、AChE介导识别与LLN活性调节、适配体识别与LLN活性调节、纳米酶联免疫吸附测定（NLISA）以及多酶级联催化。GSH-Cu LLN实现了福美双的灵敏选择性检测，检测限为2.00 ng/mL。Fe₃O₄/Cu-MOF电活性LLN实现了果蔬中福美双的比率电化学检测。Cu@COP通过裂解福美双的S-S键并形成复合物增强漆酶样活性，实现了果蔬样品中福美双的高灵敏检测。基于Cu-氨基酸配位复合物的比色传感阵列结合YOLOv8深度学习实现了农药的自动化分类。四通道传感器阵列基于四种LLN对有机磷农药（OPs）的差异调节实现了选择性识别。AChE与DNA-Cu@MOFs集成的平台通过硫代胆碱抑制机制实现了毒死蜱的检测，检测限为0.75 ng/mL。适配体调控的比色生物传感器基于适配体增强Ag基LLNs的漆酶样活性，实现了马拉硫磷、λ-氯氟氰菊酯和啶虫脒的高选择性检测。His–Cys–Cu作为天然酶替代物的NLISA对吡虫啉的检测灵敏度较传统ELISA提高了150倍。双酶级联平台集成碱性磷酸酶和ATP@[Ru(bpy)₃]²⁺ LLN实现了拟除虫菊酯的检测。基于Ce-UiO-66/Zn的磷酸水解酶样活性和Ce-CDs/MnO₂的漆酶样活性，建立了丙溴磷的级联放大传感策略，检测限为14.6 ng/mL。

4.2.3. 抗生素残留检测与消除

基于抗生素对LLNs酶活性的抑制效应，建立了多种比色传感器阵列用于多种抗生素的同时检测和区分。CuNZs的漆酶样活性催化土霉素（OTC）生成黄色产物，实现了鸡肉、猪肉和蜂蜜中OTC的检测。CeCo-MOF基比色传感器阵列利用Ce和Co与四环素类抗生素（TCs）不同官能团的配位作用，实现了TCs的区分检测。Cu-BH纳米酶的多模式检测策略利用卡那霉素诱导的活性增强和信号放大，实现了水、牛奶和蜂蜜中卡那霉素的灵敏检测。立方Ag₂O纳米颗粒和Mn-Car LLN也被用于卡那霉素的比色检测。组氨酸工程增强的Cu-BTC@His纳米酶结合机器学习实现了九种β-内酰胺类抗生素的区分，准确率达95.92%。基于三种LLNs的比色传感器阵列结合ANN和RF算法实现了五种氨基糖苷类抗生素的识别。在抗生素消除方面，基于Ce⁴⁺/Ce³⁺的Ce-UiO-66和Ce-MOF-808 LLNs通过非自由基电子转移机制的氧化降解实现了多种四环素类抗生素的高效去除，降解率超过80%。

4.2.4. 食品添加剂

基于硫化物通过Cu–S键形成增强LLN活性的机制，GMP–Cu纳米酶实现了多种食品基质中硫化物的选择性比色检测。利用不同硫化物对Cu₂(OH)₃NO₃催化的差异调节作用，构建了纳米酶传感器阵列，实现了葡萄酒、鸡蛋和牛奶中六种硫化物的区分。AlgCu漆酶纳米酶结合智能手机比色读数实现了红葡萄酒中亚硫酸盐的快速检测，检测限为4.9 μM。MA–Cu基比色方法实现了冰糖、木糖醇和小苏打等食品添加剂中硫化物的检测。MI-Bpy-Cu LLN实现了乳制品中(+)-儿茶素的检测，检测限为0.83 μg/L。CuGaa基比色方法结合逻辑门技术实现了蜂蜜中百里酚残留的快速检测。

4.2.5. 其他危害性分析物

针对酒精饮料和发酵食品中常见的副产物氨基甲酸乙酯（EC），利用适配体和分子印迹聚合物（MIP）等识别元件提高LLNs的选择性。基于适配体结合诱导立方Ag₂O NPs漆酶样活性增强的便携式比色纸基传感器实现了中国白酒中EC的检测。Cu-BH@MIP基荧光/比色双模式自校准检测平台实现了EC残留的现场检测。