基于人类单细胞RNA测序揭示衰老细胞异质性：组织依赖性特征与年龄动态

《International Journal of Molecular Sciences》：Senescent Cell Heterogeneity: Tissue-Dependent Signatures and Age Dynamics Revealed by Human scRNA-Seq Data

　　

摘要专业翻译 衰老伴随着衰老细胞（senescent cells）在多种组织中的积累，这一观点已被广泛证实。诱导细胞衰老的触发因素多种多样，且因细胞类型和器官而异，这构成了单个细胞类型内部以及组织和机体水平上衰老表型高度多样性的基础。在兼顾衰老及功能失调细胞显著多样性的前提下，识别共同的转录模式与衰老触发因素，对于制定旨在减轻衰老细胞负荷的策略至关重要。本研究旨在单细胞转录组分辨率下探究人类衰老细胞跨组织的异质性。研究人员选取了来自健康供体的皮肤、肺、小肠和大肠、肾脏及心脏的公开scRNA-seq数据。最终数据集包含来自177名年龄在15至88岁之间的供体的6种组织、约150万个细胞，涵盖64种已注释细胞类型。为鉴定细胞类型特异性衰老特征，研究人员复现并改编了SenePy库背后的特征识别算法，从而能够在给定数据集中从头鉴定与衰老及衰老状态相关的新基因。随后，针对每种细胞类型中的衰老细胞，研究人员获取了差异表达基因组，并利用涵盖功能状态、代谢活性和对各种形式细胞应激的适应性反应等广泛术语集合进行了基因集富集分析（GSEA）。由此，研究人员鉴定了不同细胞类型衰老细胞中器官特异性的衰老特征。研究人员还评估了各组织中衰老细胞抗原呈递通路及衰老相关促炎因子（SASP）产生的富集情况。此外，研究人员的分析揭示了衰老细胞与其微环境之间新型的组织特异性配体-受体互作模式。

论文解读

一、研究背景与研究目的

组织衰老是一个复杂且多层面的过程。由于修复机制并非完美高效，损伤在分子、组织乃至器官等多个层面随时间累积，最终产生整个机体的衰老表型。遗传、环境和行为因素共同决定组织功能储备与应激韧性之间的平衡。不同组织中细胞类型特异的功能和独特的局部暴露环境塑造了细胞对损伤易感性的差异，从而产生衰老表型的高度异质性。尽管目前尚无普遍公认的细胞衰老分类标准，衰老大体上可分为生理性衰老、应激诱导性衰老和继发性衰老三类。慢性应激诱导性衰老可源于复制性耗竭（RS）、癌基因激活（OIS）、代谢功能障碍（MS）或其他基因毒性因素（GTS）。尽管这些类别之间的界限具有一定人为性，特定衰老触发因素会激活特征性的转录模式和基因级联反应。值得注意的是，尽管进入衰老的触发因素和途径多样，这些过程最终汇聚于两条进化保守的通路：p53/p21和p16/pRb。无论具体通路如何，进入衰老最终导致永久的细胞周期停滞、凋亡抵抗以及炎性SASP因子的分泌，后者可在微环境中诱导邻近细胞发生继发性衰老。

研究人员通常将衰老相关疾病的发展与衰老细胞的积累联系起来。理解衰老细胞的异质性、识别衰老细胞的共同特征以及解析细胞在生理和病理条件下进入衰老的轨迹，对于开发减轻衰老细胞负荷、促进健康长寿的技术具有重要意义。单细胞RNA测序（scRNA-seq）为研究组织衰老和阐明衰老细胞如何与组织中健康细胞相互作用提供了广阔机遇。本研究利用来自不同年龄表观健康供体的多个组织的公开scRNA-seq数据，旨在探究衰老细胞跨组织的异质性，确定不同细胞类型中衰老细胞的积累速率，并识别细胞衰老的共同模式。此外，研究人员还检查了各组织中衰老细胞与正常细胞之间的局部相互作用，以识别微环境中衰老诱导的可能途径。

二、研究内容与主要发现

本研究聚焦于皮肤、肺、大肠和小肠、肾脏及心脏六种组织scRNA-seq分析中注释的细胞类型。研究人员从头应用SenePy算法，为通过质量过滤的每种细胞类型推导出独特的衰老特征。基于这些特征，计算每个细胞的衰老评分并构建相应分布，随后利用自适应高斯混合模型（GMM）阈值鉴定各细胞类型中的衰老细胞。研究人员使用SenMayo基因集作为基准进行验证，效应量分析显示，在所检组织绝大多数细胞类型中，SenMayo基因在衰老细胞群体中显著富集。

通过分析供体年龄与各注释细胞类型内衰老细胞积累之间的相关性，研究发现衰老细胞积累的年龄依赖性存在显著的组织异质性。皮肤中相关性最强，成纤维细胞、静脉内皮细胞、周细胞、单核细胞来源细胞及CD4⁺和CD8⁺ T淋巴细胞的衰老细胞比例随年龄增长最为显著。肺中肺泡I型细胞、毛细血管和淋巴管内皮细胞及杯状细胞中也检测到衰老细胞丰度的显著增加。大肠中衰老成纤维细胞、肠上皮细胞和B淋巴细胞丰度随年龄显著增加，回肠中衰老浆细胞和肾脏中衰老CD4⁺ T淋巴细胞亦有积累。其他细胞类型也呈现衰老细胞丰度随年龄增加的趋势，但相关性未达统计学显著。

三、关键技术方法

研究人员收集了来自177名年龄15至88岁健康供体的公开scRNA-seq数据，涵盖皮肤、肺、小肠、大肠、肾脏和心脏六种组织。对于皮肤、肺、小肠和结肠，获取原始测序数据并使用10× Genomics Cell Ranger v.9.0.1生成计数矩阵；肾脏和心脏使用已发表的计数矩阵。质量控制后最终数据集约含150万个细胞。主要技术方法包括：使用scVI进行样本整合，使用scANVI从Tabula Sapiens图谱转移标签进行细胞类型注释；复现SenePy算法，基于基因年龄动态（GAD）评分和基因共表达网络分析鉴定细胞类型特异性衰老特征；使用scanpy.score_genes计算衰老评分，基于双组分GMM的自适应二值化阈值鉴定衰老细胞；使用AUCell进行SenMayo特征富集验证；使用edgeR进行伪bulk差异基因表达分析（DGEA）；使用gseapy进行预排序GSEA；使用LIANA+进行配体-受体相互作用分析。

四、研究结果

2.1 衰老细胞丰度跨组织的年龄相关动态

通过分析供体年龄与衰老细胞比例的相关性，发现衰老细胞积累呈现显著组织异质性。屏障组织（皮肤、肺和肠道）中显著相关性最多，反映了外源性应激源对衰老细胞积累的贡献以及不同器官上皮和基质区室增殖活性和更新率的差异。

2.2 衰老细胞跨组织的转录异质性

GSEA分析揭示了组织特异性富集模式。皮肤、心脏和大肠中，内皮和间充质来源细胞表现出细胞周期阻滞、DNA损伤反应（DDR）、代谢重编程和SASP因子分泌相关通路的最强富集。肺、小肠和肾脏中，SASP相关炎症通路富集最为显著且主要发生在上皮细胞中。某些细胞类型还显示增殖相关通路富集，伴随DNA损伤反应和端粒应激通路的一致富集，与复制性耗竭诱导的衰老模式一致。

2.3 抗原加工呈递上调与炎症通路激活是跨组织衰老细胞的标志

衰老细胞中普遍检测到抗原加工呈递程序的激活。皮肤和肺中，非经典间充质和内皮细胞群体中MHC-II依赖性抗原呈递被激活。心脏、大肠、小肠和肾脏的多种细胞类型也显示MHC-II或MHC-I依赖性抗原呈递的富集。在大多数衰老细胞类型中，抗原呈递基因的上调伴随促炎细胞因子和SASP因子产生相关通路的富集，表明衰老细胞具有潜在免疫原性。

2.4 跨组织和细胞类型衰老触发因素与机制的图谱

通过将60个衰老相关基因集分类为复制性（RS）、基因毒性（GTS）、癌基因诱导样（OIS）和代谢相关（MS）衰老程序，发现一定程度的组织特异性。皮肤和肺中间充质和内皮细胞富集OIS基因；心脏大多数细胞类型上调MS基因；大肠肠上皮细胞、B淋巴细胞和隐窝干细胞及回肠潘氏细胞富集复制性耗竭相关基因。值得注意的是，算法鉴定的衰老心肌细胞表现出经典衰老特征和广泛公认衰老标志物的显著下调，表明某些细胞类型中经典衰老标志物不具信息性。

2.5 衰老细胞驱动的跨组织细胞间信号传导

利用LIANA算法分析了超过534,000种配体-受体互作组合，保留了9,829个显著互作。皮肤中衰老成纤维细胞、周细胞和静脉内皮细胞通过细胞外基质成分、黏附分子和趋化因子发挥主导影响。肺中衰老巨噬细胞、杯状细胞和毛细血管内皮细胞是炎症信号的主要来源。心脏中衰老成纤维细胞和壁细胞通过细胞外基质重塑因子、半乳糖凝集素和血管生成因子调节微环境。大肠中衰老成纤维细胞通过生长因子、钙结合蛋白和MHC I类分子发挥最高信号活性。回肠中衰老杯状细胞通过半乳糖凝集素家族和层粘连蛋白发挥最大影响。肾脏中衰老上皮细胞和单核/巨噬细胞通过MHC II类分子靶向LAG3抑制性受体和GRN-TNFRSF1A/B轴发挥显著效应。值得注意的是，衰老细胞在所有组织中均表现出活跃的免疫逃逸特征，通过上调MHC-I分子（包括非经典HLA-E）和B2M与NK细胞上的KLRD1(CD94)/KLRC1(NKG2A)抑制性复合物结合，以及表达MHC-II和半乳糖凝集素-3与T淋巴细胞上的LAG3抑制性受体结合，此外还通过THBS1-CD47轴传递“别吃我”信号抑制巨噬细胞吞噬。

五、讨论与结论

讨论部分指出，SenePy算法的准确性通过SenMayo特征在几乎所有衰老细胞类型中的显著富集得到验证，但心肌细胞和皮肤树突状细胞呈现相反趋势。心肌细胞中SenMayo特征的抑制可能源于增殖细胞与有丝分裂后细胞衰老的根本生理差异，研究人员通过文献筛选的心脏选择性衰老特征验证了算法的可靠性。衰老细胞积累在屏障组织中最为显著，反映了外源性应激和免疫清除能力下降的贡献。尽管衰老细胞转录程序高度异质性，抗原呈递和炎症信号通路的共同激活表明衰老细胞具有潜在免疫原性。衰老细胞通过表达广泛的免疫检查点抑制分子实现免疫逃逸，这一机制可能构成年龄相关免疫清除效率下降的基础，靶向这些通路有望开发新型衰老干预策略。

研究结论指出，通过对177名年龄15至88岁表观健康供体六种组织约150万个细胞的分析，研究人员为64种细胞类型鉴定了细胞衰老特征。获得的全面数据显示了衰老细胞跨组织积累的动态及其转录异质性。衰老细胞在所有被检组织中均表现出通过表达广泛免疫检查点抑制剂逃避免疫监视的显著能力，这一机制可能构成年龄相关免疫系统清除衰老细胞效率下降的基础，靶向这些通路有望开发新型抗衰老策略。