《International Journal of Molecular Sciences》：High Glucose Induces Biomolecular Dysregulation in Primary Human Corneal Epithelial Cells: Potential Biomarkers of Hyperglycemia-Driven Corneal Impairment
编辑推荐：
摘要专业翻译
角膜高血糖与以炎症、氧化应激、神经病变和先天免疫机制受损为特征的上皮功能障碍相关，正如在糖尿病角膜病变中所观察到的那样。因此，本研究旨在细胞水平上探讨中度至重度急性和慢性葡萄糖刺激对人原代角膜上皮细胞（CECs）的影响。研究人员将人CECs（In
摘要专业翻译
角膜高血糖与以炎症、氧化应激、神经病变和先天免疫机制受损为特征的上皮功能障碍相关，正如在糖尿病角膜病变中所观察到的那样。因此，本研究旨在细胞水平上探讨中度至重度急性和慢性葡萄糖刺激对人原代角膜上皮细胞（CECs）的影响。研究人员将人CECs（Innoprot，西班牙）暴露于补充15 mM或30 mM高糖（HG）的培养基（含5 mM葡萄糖的CEC培养基）中，每2天进行一次单次或重复刺激，并在第1天（单次/急性刺激）或第3天和第5天（重复/慢性刺激）收获细胞。甘露醇用作渗透压对照，细胞存活率通过台盼蓝排斥试验和MTT法监测。条件培养基用于蛋白质分析，而单层细胞用于实时相对RT-PCR检测。研究人员检测了属于炎症、补体、先天受体、氧化、DNA酶和神经营养通路中的少数选定介质，并对选定介质（IL-6、IL-8、CFH和C5b-9；ELISA）进行了蛋白水平检测。HG暴露诱导CEC代谢活性呈时间和浓度依赖性下降，但细胞数量并无相应减少。急性HG暴露促进炎症反应，表现为p65NF-κB、IL-1β、IL-6和IL-8转录本增加，同时补体成分早期调节以及CD55和CD59（调节因子）表达增加。慢性HG暴露则显著转向补体激活，C3aR1、C5aR1、C3、C5和C9转录本增加，CD55和CD59表达减少，CFH和C5b-9蛋白呈正相关关系进行性积累。慢性HG还增加了IL-6和IL-8蛋白释放，并诱导C5、C5aR1和TLR-2的协调性上调，尤其在30 mM HG条件下。抗氧化、DNA酶和神经营养通路随时间呈现差异性调节，早期Nrf-2反应随后出现慢性Keap-1上调和Nrf-2减少，DNMT3a/HDAC1表达进行性增加，以及β-NGF/BDNF转录谱呈双相变化。总体而言，这些发现支持所提出的CEC对高血糖反应的双相模型，其特征为初始适应性分子反应，随后在长期暴露下出现进行性失调。这一早期分子谱可能代表对急性代谢应激的适应性反应，但仍需进一步研究以确认其功能性保护意义。
论文解读文章
一、研究背景与研究目的
角膜上皮是眼球最外层的细胞屏障，承担抵御环境损伤和参与先天免疫监视的重要功能。糖尿病作为一种代谢性疾病，会在眼表引发一系列形态和功能改变，影响角膜神经和上皮完整性，导致干眼不适或疾病。高血糖对角膜表面的损伤是多因素且常被低估的。在细胞层面，慢性高糖暴露驱动线粒体功能障碍，导致活性氧（ROS）过度产生，与晚期糖基化终末产物（AGEs）协同作用，引发神经营养缺陷、轴突变性和内皮功能障碍。除代谢和氧化机制外，先天免疫反应、补体系统和神经营养因子参与已被视为糖尿病靶器官病理反应的新层面。
补体片段和属于先天免疫的Toll样受体（TLRs）协同保障宿主防御，而糖尿病会使其受损或失调，转而产生有害效应并驱动系统性炎症。补体失调已在糖尿病多个靶器官中被证实，高血糖可通过AGE介导的通路诱导补体激活，随后下调膜结合调节蛋白并损害液相抑制功能，这些机制主要在视网膜和肾脏中被表征，但在角膜上皮中仍研究不足。既往使用永生化细胞系的研究表明，高糖可抑制TLR-2/TLR-4表达，可能损害对病原体的先天免疫反应。
尽管氧化应激和生长因子失调已在糖尿病角膜中得到广泛表征，但一些促炎、补体和先天免疫信号对高血糖驱动的角膜上皮细胞转录反应的贡献仍知之甚少。因此，本研究旨在探讨高糖对人原代角膜上皮细胞（CECs）的时间和剂量依赖性效应，分别在单次暴露（第1天收获，急性刺激）和多次暴露（每2天一次，第3天或第5天收获，慢性刺激）条件下进行。
二、研究设计与主要结论
研究人员将人原代角膜上皮细胞（CECs，购自Innoprot，西班牙，共3批次）暴露于补充15 mM或30 mM葡萄糖的培养基中，每2天进行一次刺激，分别在第1天（急性）、第3天和第5天（慢性）进行采样。甘露醇用作渗透压对照。通过台盼蓝排斥试验和MTT法监测细胞存活率和代谢活性，通过实时RT-PCR检测转录水平，通过ELISA检测蛋白水平。
研究得出以下主要结论：HG暴露诱导CEC代谢活性呈时间和浓度依赖性下降，但细胞数量无相应减少，提示细胞处于亚致死应激状态。急性HG暴露促进炎症反应（p65NF-κB、IL-1β、IL-6和IL-8转录本增加），伴随补体成分的早期调节和CD55/CD59调节因子上调。慢性HG暴露则转向补体激活（C3aR1、C5aR1、C3、C5和C9上调，CD55/CD59下调），CFH和C5b-9蛋白进行性积累并呈正相关。慢性HG还增加IL-6和IL-8蛋白释放，并诱导C5、C5aR1和TLR-2的协调性上调，尤其在30 mM HG条件下。抗氧化通路呈现早期Nrf-2反应后转为慢性Keap-1上调和Nrf-2减少的模式，DNMT3a/HDAC1进行性表达增加，β-NGF/BDNF呈双相转录谱。这些发现支持CEC对高血糖反应的双相模型：初始适应性分子反应，随后在长期暴露下出现进行性失调。
三、关键技术方法
本研究采用的主要技术方法包括：人原代角膜上皮细胞体外培养体系（细胞购自Innoprot，西班牙，使用含5 mM葡萄糖的完全角膜上皮细胞培养基）；台盼蓝排斥试验用于活细胞计数；MTT法用于代谢活性检测；实时荧光定量RT-PCR（SYBR-green法，以H3为内参基因，REST软件分析）用于转录水平检测；ELISA用于条件培养基中IL-6、IL-8、CFH蛋白及细胞裂解物中C5b-9蛋白的定量检测；Pearson相关性分析用于评估变量间线性关联。
四、研究结果
4.1 高糖在急性和慢性刺激下影响促炎介质的转录表达
通过实时RT-PCR检测发现，p65NF-κB mRNA随时间呈上升趋势，在30 mM HG第5天达到峰值。IL-1β mRNA在所有条件下均高于2 Log-FC，第5天在15 mM和30 mM HG下表达最高。IL-6 mRNA呈时间依赖性增加，在15 mM HG下达到峰值。IL-8 mRNA在第1天最高，随后呈时间依赖性下降。ELISA结果显示，慢性刺激下IL-6和IL-8蛋白水平升高，且第5天IL-6与IL-8蛋白水平呈显著正相关（r=0.4388，p=0.0189）。
4.2 高糖影响补体受体、效应片段和调节因子的转录表达
研究发现C3aR1和C5aR1转录水平在所有时间点呈显著正相关（r=0.3450，p<0.0001）。急性刺激下，C3aR1、C5aR1、C3、C5、C9和CFH呈下调趋势，而CD55和CD59从第1天到第3天上调。慢性条件下补体谱反转：C3aR1在15 mM HG下显著上调，C5aR1在两种浓度下均显著上调，C3、C5和C9在两种浓度下均上调（C5和C9在30 mM下表达更高），CFH在第5天两种浓度下均上调，而CD55和CD59下调。蛋白水平上，CFH释放呈HG浓度依赖性增加（30 mM HG第5天显著升高），细胞相关C5b-9蛋白随HG暴露进行性积累，且第5天CFH与C5b-9呈显著正相关（r=0.4886，p=0.0245）。
4.3 高糖影响TLR-2而非MyD88的表达
急性刺激下TLR-2和MyD88转录本在两种浓度下均显著失调（下调趋势）。慢性30 mM HG暴露选择性上调TLR-2转录本，而MyD88无显著变化。C5、C5aR1和TLR-2在慢性刺激后均显著上调，尤其在30 mM HG下超过2 Log-FC阈值。
4.4 急性和慢性高糖暴露差异性地影响主要抗氧化介质和部分表观遗传靶点
第1天和第3天，Keap-1转录本轻度失调，而Nrf-2在两种浓度下均显著上调。第5天，Keap-1在两种浓度下均显著上调，而Nrf-2呈相反效应（下调）。iNOS在第1天和第3天轻度失调，第5天在两种浓度下均呈上升趋势。DNMT3a和HDAC1从第1天到第5天呈进行性上调，DNMT3a在15 mM HG第3天和第5天显著升高，HDAC1在15 mM HG第5天显著升高。
4.5 高糖触发β-NGF和BDNF的表达谱变化
第1天，β-NGF在30 mM HG下选择性显著上调，BDNF在两种浓度下均增加。第3天两种神经营养因子均显著降低。第5天出现部分恢复：β-NGF在30 mM HG下显著上调，BDNF在15 mM HG下显著增加。
五、讨论与结论
讨论部分指出，本研究通过整合转录谱分析和生化检测，揭示了CEC对高糖暴露呈时间和剂量依赖性反应，表现为初始适应阶段后转为进行性分子和生化失调。急性期补体反应（15 mM HG）表现为C3aR1、C5aR1、C3、C5和CFH下调以及CD55/CD59上调，可能反映协调的稳态策略；而30 mM HG暴露破坏了这一平衡。慢性期补体调节因子下调而C3aR1/C5aR1上调，提示从急性控制转向慢性调节失控。CFH上调可能代表不足以阻止C5b-9积累的代偿性修复尝试，C5b-9可能以亚裂解方式放大IL-6和IL-8释放，维持促炎循环。C5/C5aR1与TLR-2在30 mM HG慢性刺激下的表达趋同，提示两者存在分子串扰，可能加剧糖尿病角膜病变。Keap-1/Nrf-2轴的时序变化反映了从急性抗氧化反应到慢性氧化应激积累的转变。DNMT3a和HDAC1的进行性上调提示表观遗传机制可能锁定慢性高血糖反应的转录变化。β-NGF和BDNF的双相表达谱反映了神经保护与神经退行之间的动态平衡。
研究结论为：这项体外研究为理解高血糖波动对角膜上皮细胞的有害效应提供了新信息，显示多个分子轴呈时间有序、高度动态且趋同的激活模式。中度HG暴露触发适应性补体反应，而重度HG暴露破坏这一保护效应。急性暴露以IL-1β和IL-6上调、补体和TLR-2失调以及补体抑制剂上调为特征，可能代表细胞限制/靶向先天免疫反应的策略。慢性HG暴露则以急性相关转录谱的进行性失效、潜在的C5/C5aR1与TLR-2串扰、补体调节因子和抗氧化因子失调以及炎症介质的持续分泌为特征。将细胞层面的输出转化为更复杂系统（聚焦糖尿病角膜病变），高糖介导的角膜表面损伤可能不是代谢损伤的被动后果，而是严格依赖于长期高血糖波动的主动且自我维持的先天免疫程序。这一生物分子谱——急性控制和慢性放大反应的结果——可能为开发保护角膜完整性或对抗糖尿病诱导的角膜病变的替代策略提供实际支持。
