RAS/MAPK通路过度激活触发成年发病的运动轴突变性

《iScience》：Excessive activation of the RAS/MAPK pathway triggers adult-onset motor axonal degeneration

　　

轴突和突触变性是神经退行性疾病的关键病理特征，但其分子机制仍未完全阐明。在本研究中，研究人员在果蝇中进行了一项无偏的正向遗传镶嵌筛选，以鉴定成年运动轴突和神经肌肉接头（neuromuscular junctions, NMJs）维持所需的基因。研究人员鉴定出30个基因中的49个致病变变，其中8个引起成年发病的进行性变性。pebbled（peb）——果蝇RAS响应元件结合蛋白1（RAS-responsive element binding protein 1, RREB1）的直系同源物——的功能缺失导致成年发病的运动轴突和NMJ变性，以及年龄依赖性运动缺陷。peb编码一种C₂H₂锌指转录因子，负调控RAS/MAPK通路靶基因的转录，其功能缺失导致RAS/MAPK通路过度激活。其他RAS/MAPK通路负调控因子的功能缺失同样诱导成年发病的进行性NMJ变性和运动缺陷。重要的是，用MEK1/2抑制剂mirdametinib处理成年果蝇，可剂量依赖性地挽救peb突变体的运动神经退行性表型。因此，RAS/MAPK通路过度激活触发成年发病的进行性神经退行性变，而该过程可通过抑制RAS/MAPK通路加以预防。

神经退行性疾病（neurodegenerative diseases）通常呈成年发病、进行性发展的特征，以特定神经元群体的选择性变性为病理核心。轴突变性（axonal degeneration）是多种神经退行性疾病的突出早期病理特征，轴突和突触前终末往往是最先受累的神经元结构。然而，神经退行性变的分子机制仍不明确，绝大多数疾病缺乏有效的疾病修饰治疗手段。为此，研究人员在果蝇（Drosophila melanogaster）中设计了一种独特的无偏正向遗传镶嵌筛选（forward genetic mosaic screen）策略，以鉴定成年运动轴突维持所必需的基因。

研究人员利用低浓度EMS（ethyl methanesulfonate，乙基甲磺酸酯）在FRT19A染色体上引入随机突变，结合MARCM（mosaic analysis with a repressible cell marker，可抑制细胞标记的镶嵌分析）技术，通过OK371-GAL4驱动膜结合GFP（mCD8::GFP）标记腿部谷氨酸能运动神经元和感觉神经元，在21天龄果蝇的腿部对运动轴突和神经肌肉接头（neuromuscular junction, NMJ）形态进行荧光显微筛查。研究人员建立了8,892个突变品系，覆盖X染色体约88%的必需基因，共鉴定出30个基因中的49个致病变变；其中29个（97%）基因具有人类直系同源物，19个（66%）基因的人类同源基因此前已与神经发育或神经退行性疾病相关联，验证了该筛选的疾病相关性。

在表型时序分析中，研究人员将非细胞致死突变体分为发育非进行性、发育进行性和成年发病进行性三类，其中8个基因的突变导致成年发病进行性变性。研究人员重点聚焦于pebbled（peb），即人类RAS响应元件结合蛋白1（RAS-responsive element binding protein 1, RREB1）的果蝇直系同源物。peb编码C₂H₂锌指转录因子，负调控RAS/MAPK通路靶基因的转录。pebQ894X、pebE8及peb345x三种突变均导致成年发病的进行性运动轴突和NMJ变性，并伴随年龄依赖性攀爬运动缺陷，而含野生型peb的BAC转基因可完全挽救上述表型。peb功能缺失不影响感觉神经元和蘑菇体β叶神经元形态，提示运动神经元对peb缺失具有选择性易感。温度敏感的GAL80时序实验进一步证明，仅在成年期敲低peb即可诱导NMJ变性，证实Peb在成年轴突维持中发挥持续性作用。

在分子机制研究中，TUNEL（Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling，末端脱氧核苷酸转移酶dUTP缺口末端标记）检测未发现凋亡信号增加，抗凋亡蛋白p35表达不能挽救NMJ表型，bsk杂合突变也不修饰变性表型，排除了凋亡和JNK信号通路的参与。dSarm水平调控和NMN-D（NMN-deamidase，NMN脱酰胺酶）表达均不能改变peb突变体的NMJ变性，排除了Wallerian变性（Wallerian degeneration）通路的参与。peb突变运动神经元中α-微管蛋白乙酰化水平显著降低，但HDAC6（histone deacetylase 6，组蛋白去乙酰化酶6）抑制剂Tubastatin A恢复乙酰化水平后并不能挽救NMJ变性；自噬起始受损导致Ref(2)P（p62同源物）阳性颗粒积累，但mTORC1抑制剂雷帕霉素（rapamycin）恢复自噬后同样不能改善运动缺陷或NMJ变性。

RAS/MAPK通路过度激活的验证方面，peb功能缺失导致运动神经元中磷酸化ERK（phospho-ERK, pERK）和总ERK（total-ERK, tERK）水平显著升高，rolled（果蝇ERK直系同源物）mRNA表达上调。敲低其他RAS/MAPK负调控因子Lztr1、Spred和Nf1，以及表达组成性活性RAS（RasR68Q），均诱导成年发病的NMJ变性。Sin3a和Su(var)3-3（RREB1介导转录抑制所需的染色质调控因子）的敲低同样导致NMJ变性，表明Peb与Sin3a和Su(var)3-3形成复合体发挥转录抑制作用。FDA批准的MEK1/2抑制剂mirdametinib以剂量依赖方式挽救peb敲低导致的运动缺陷，1 μM浓度完全挽救peb突变体NMJ变性和Nf1单倍剂量不足相关的NMJ变性，同时恢复pERK水平。mirdametinib还逆转了α-微管蛋白乙酰化降低和Ref(2)P积累，证明这些缺陷是RAS/MAPK通路过度激活的下游后果。

讨论部分强调，本筛选策略的独特之处在于以成年果蝇腿中运动轴突和NMJ形态作为读出的活体成像筛选，补充了传统RNAi筛选的不完全敲低局限。与神经发育障碍相关的人类同源基因中，60%的果蝇突变体呈现进行性神经变性，提示神经发育障碍可能伴随晚年神经退行性风险。研究结论表明：RAS/MAPK通路过度激活足以触发成年发病的进行性运动轴突变性，而遗传或药理学抑制该通路可完全阻止这一过程。该发现将RAS/MAPK过度激活确立为神经退行性变的分子机制之一，为RAS病（RASopathy）相关神经病变提供了机制解释，并提示MEK1/2抑制剂可能成为RAS病及更广泛神经退行性疾病的潜在治疗策略。研究局限性在于筛选限于X染色体，且因X连锁致死性主要分析雌性，无法全面评估性别特异性效应。