《iScience》：Three sampling strategies reveal spatial and methodological patterns in macroinvertebrate diversity in freshwater habitats
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评估大型无脊椎动物多样性对于淡水生态系统管理至关重要。环境DNA（eDNA）宏条形码技术已成为一种强大的非侵入性工具，可补充传统形态学方法。本研究在位于中国图们江流域的布尔哈通河和海兰河，比较了形态学采样、保存标本乙醇来源的eDNA以及水体eDNA三种策略对大
评估大型无脊椎动物多样性对于淡水生态系统管理至关重要。环境DNA（eDNA）宏条形码技术已成为一种强大的非侵入性工具，可补充传统形态学方法。本研究在位于中国图们江流域的布尔哈通河和海兰河，比较了形态学采样、保存标本乙醇来源的eDNA以及水体eDNA三种策略对大型无脊椎动物多样性的评估效果。水体来源的eDNA揭示了最高的物种丰富度和α多样性，凸显了方法特异性的检出模式。尽管存在这些偏差，宏条形码序列读数丰度与形态学数据之间的强相关性支持了三种方法在生境内（α）多样性评估中的可靠性。各方法间一致的β多样性模式进一步验证了其可比性。在环境因子中，总悬浮固体（TSS）成为主要驱动因子，α多样性在中等的TSS水平达到峰值，这与中度干扰假说一致。通过整合形态学鉴定、乙醇eDNA和水体eDNA宏条形码，本研究证明尽管存在方法特异性偏差，所有方法均捕捉到了东亚国际边境沿线河流大型无脊椎动物群落一致的生态梯度。
论文解读：三种采样策略揭示淡水大型无脊椎动物多样性的空间与方法学格局
一、研究背景与科学问题
淡水生态系统是全球生物多样性保护的重点区域，但人类活动、气候变化与环境污染已导致淡水生物种群数量在四十年间下降超过80%。大型无脊椎动物作为淡水食物网的重要组成部分，其群落组成与多样性常被用作评价水生态系统健康的生物指标，尤其是蜉蝣目（Ephemeroptera）、襀翅目（Plecoptera）、毛翅目（Trichoptera）和双翅目（Diptera）等EPTD类群对环境变化高度敏感。然而，传统形态学调查依赖踢网或沉积物采样器，不仅对栖息地造成干扰，而且形态学鉴定耗时费力，且对幼龄阶段生物鉴定困难。环境DNA（eDNA）宏条形码技术通过从水、土壤等环境样品中提取总DNA，扩增标准化条形码区域并进行高通量测序，能够以非侵入性、高分辨率的方式检测物种组成，成本效益优于传统方法。已有研究表明，水体eDNA（water-eDNA）常检出更多物种，但可能包含从上游运输来的DNA，混淆局地群落推断；而保存液乙醇中捕获的eDNA（ethanol-eDNA）更接近局地物种组成。目前，系统比较这三种方法并评估其在揭示群落-环境关系方面一致性的研究仍然缺乏。为此，研究人员在中国东北图们江流域的布尔哈通河与海兰河，整合常规形态学采样、乙醇eDNA宏条形码和水体eDNA宏条形码，评估大型无脊椎动物多样性，并探究三个问题：（1）三种方法在分类检出模式上有何差异；（2）β多样性模式与环境关联是否跨方法一致；（3）哪些环境因子塑造群落组成与多样性。
二、研究样本与方法概述
研究于2022年6月在图们江流域布尔哈通河与海兰河沿岸31个位点开展，覆盖面积约7064 km2。每个位点采集三份1升水样用于水体eDNA（分别取自左、中、右水面下约5 cm处），另采集2升水样用于环境因子测定。大型无脊椎动物使用D形网（40目，孔径0.25 mm）逆流扫网100 m河段，经现场挑拣后保存于99%乙醇中。形态学标本在实验室鉴定至最低可能分类单元。保存20天后，取10 mL乙醇溶液过滤用于乙醇eDNA分析。选择通用引物LCO1490/ZBJ-ArtR2c扩增约178 bp的COI基因片段，采用PCR-free建库，在MGISEQ-2000平台进行PE150测序。生物信息学流程使用QIIME2，经过去多重化、引物标签修剪、去噪去嵌合体、生成ASV，并与GenBank数据库（2024年1月版本）比对，以98%相似度阈值和阴性对照计数阈值过滤。统计分析包括Kruskal-Wallis检验比较EPTD类群物种数、α多样性指数（物种丰富度、ACE、Chao1、Shannon-Wiener、Simpson）计算、基于Bray-Curtis距离的NMDS排序与Procrustes分析检验β多样性一致性、层次分割（HP）评估环境因子独立贡献、冗余分析（RDA）检验环境对α多样性的约束作用，以及广义加性模型（GAM）可视化α多样性沿总悬浮固体（TSS）梯度分布。
三、主要研究结果
（1）大型无脊椎动物群落组成
形态学采样共采集2398个个体，鉴定出189个分类单元，隶属于3门、4纲、15目、55科、114属，其中99个分类单元鉴定到种水平。乙醇eDNA宏条形码获得2,669,728条序列读数，检出174个分类单元（147个有效种）；水体eDNA获得131,641条读数，检出212个分类单元（176个有效种）。三种方法共有的门相同，两种eDNA方法检出的纲一致。从目到种水平，方法间共享的分类单元逐渐减少，但两种eDNA方法的相似性高于它们各自与形态学方法的相似性。Kruskal-Wallis检验显示，在非EPTD类群中，两种eDNA方法检出的物种数显著多于形态学方法；但在蜉蝣目（Ephemeroptera）中，形态学鉴定检出的物种数显著多于两种eDNA宏条形码方法，这可能反映了引物偏好或参考数据库不足。
（2）大型无脊椎动物α与β多样性
水体eDNA的所有α多样性指数均显著高于乙醇eDNA。两种eDNA方法的物种丰富度、ACE和Chao1指数均显著高于形态学方法（p < 0.05）。Shannon-Wiener和Simpson指数方面，水体eDNA与形态学方法无显著差异，而乙醇eDNA显著低于后两者（p < 0.05）。相关分析发现，形态学个体数与两种eDNA方法的序列读数之间存在显著相关性；乙醇eDNA读数的Shannon-Wiener、物种丰富度和Chao1指数与形态学分类单元显著相关，而水体eDNA仅物种丰富度与形态学显著相关。基于Bray-Curtis距离的NMDS排序的Procrustes分析显示，三种方法检出的群落结构在β多样性层面具有显著一致性（p < 0.05），表明所有方法均能可靠揭示大尺度群落格局。
（3）环境变量对群落的影响
层次分割分析显示，在八项环境变量中，总悬浮固体（TSS）对三种方法检出的群落组成均有最高的独立贡献，对α多样性的独立贡献达到47.74%（p < 0.01），而其他变量未达显著水平。冗余分析（RDA）证实环境因子显著约束大型无脊椎动物α多样性（p = 0.015），解释了42.5%的总方差，其中TSS是唯一对α多样性有显著负向影响的变量（p < 0.05）。广义加性模型（GAM）展示，TSS解释了α多样性指数变异的60.15%（p < 0.01）；形态学数据的物种丰富度、Chao1和ACE在较低TSS时较高，而形态学的Shannon-Wiener和Simpson指数以及两种eDNA方法的所有α多样性指数均在中等的TSS水平达到峰值，这与中度干扰假说一致。
四、总结与讨论
本研究发现，三种采样策略在较高分类水平上群落组成一致，但在物种水平出现分歧，各方法捕获了群落互补的方面。水体eDNA检出分类单元最多，能力源于对稀有、隐存或早期生命阶段生物的DNA检测；而乙醇eDNA检出的分类单元少于形态学，可能与硬壳或硬外骨骼生物释放DNA较少、引物偏好、参考数据库空缺等因素有关。尽管α多样性估计受方法偏差影响，但三种方法在β多样性上的一致性证明它们都能有效捕捉生态梯度。TSS作为主要环境驱动因子，其效应在中等水平促进多样性峰值，支持中度干扰假说。研究局限性包括参考数据库覆盖不全、单一引物对和较低测序深度可能遗漏稀有类群、单次采样（2022年6月）时空范围有限，以及TSS作用可能与方法差异混杂。未来应优化引物组合、提高测序深度、扩充参考数据库并扩大时空采样范围，以提升eDNA生物多样性评估的分辨率和应用价值。研究结论部分翻译如下：通过整合形态学鉴定、乙醇eDNA和水体eDNA宏条形码，本研究证明尽管存在方法特异性偏差，所有方法均捕捉到了东亚国际边境沿线河流大型无脊椎动物群落一致的生态梯度，表明eDNA宏条形码可作为传统形态学监测的有效补充工具。
