《Cell Genomics》：Pre-diagnosis plasma cell-free DNA reveals early signatures of prostate and breast cancer risk up to eight years prior to clinical detection
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研究人员对491例诊断前乳腺癌和前列腺癌血浆样本进行了全基因组游离细胞DNA（cell-free DNA, cfDNA）甲基化谱分析，其中部分样本在临床诊断前长达九年前采集，鉴定出早期癌症相关表观遗传改变和预测性特征。差异甲基化区域（differentiall
研究人员对491例诊断前乳腺癌和前列腺癌血浆样本进行了全基因组游离细胞DNA（cell-free DNA, cfDNA）甲基化谱分析，其中部分样本在临床诊断前长达九年前采集，鉴定出早期癌症相关表观遗传改变和预测性特征。差异甲基化区域（differentially methylated regions, DMRs）富集于调控元件和重复元件，并反映了癌症组织和免疫细胞相关的DNA甲基化模式。基于发现集样本训练的Logistic回归模型显示，cfDNA沉默子（silencer）区域甲基化可稳健预测未来前列腺癌，高风险个体发生前列腺癌的风险增加3.55倍。增强子（enhancer）高甲基化对偶发性乳腺癌的预测能力中等，但能强效区分已确诊的晚期乳腺癌，高风险个体风险增加2.3倍。这些结果凸显cfDNA甲基化作为早期癌症风险预测和监测的有前景生物标志物。
研究背景与目的
癌症早期发现可显著改善治疗疗效和生存结局，但癌症仍是全球第二大死亡原因，高死亡率往往与晚期诊断相关。现有早期检测手段包括影像学和组织活检，其效果在不同组织类型和疾病分期中差异较大，常规人群筛查因而仅局限于少数癌种。液体活检可通过血浆游离细胞DNA（cell-free DNA, cfDNA）甲基化检测与病灶发展相关的组织特异性分子信号，用于多癌种早期检测。然而，现有绝大多数早期检测生物标志物都是在癌症临床确诊后开发，针对诊断前无症状个体的cfDNA甲基化组研究非常有限。此前有研究在肺癌、肝癌、结直肠癌和胃癌诊断前4年检测到预测性cfDNA信号，但针对早期乳腺癌和前列腺癌的性能仍然有限，可能与其早期cfDNA脱落率低有关。因此，研究人员利用安大略健康研究（Ontario Health Study, OHS）这一大型前瞻性人群队列，在临床诊断前血浆中开展全基因组cfDNA甲基化谱分析，旨在鉴定并评估与癌症发生相关的最早期预测信号。该研究共对491份诊断前血浆样本进行分析，包括93例前列腺癌、171例乳腺癌和227例无癌对照，样本采集距诊断2周至9年不等。结果提示，cfDNA甲基化可作为早期癌症风险预测和监测的有前景生物标志物。
主要技术方法
研究人员采用细胞游离甲基化DNA免疫沉淀测序（cell-free methylated DNA immunoprecipitation sequencing, cfMeDIP-seq）对OHS队列每份1.6 mL血浆样本（平均提取cfDNA 11.9 ng）进行全基因组甲基化谱分析。质量控制后样本随机分为发现集和留出测试集。使用DESeq2负二项模型鉴别差异甲基化区域（DMRs），并与癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas, TCGA）肿瘤组织Illumina 450k甲基化芯片数据及外周血白细胞（peripheral blood leukocytes, PBLs）比较；采用惩罚逻辑回归和重复10折交叉验证构建风险预测模型，以时间依赖性曲线下面积（time-dependent AUC, tAUC）、一致性指数（concordance index, C-index）和Kaplan-Meier曲线评估；并在OCTANE晚期乳腺癌、Chen等前列腺癌和Burgener等头颈鳞状细胞癌（head and neck squamous-cell carcinoma, HNSC）外部队列中验证。
研究结果
参与者人口统计学与研究设计
研究人员通过cfMeDIP-seq对OHS诊断前血浆样本进行全基因组cfDNA甲基化分析。多数前列腺癌确诊时为I期或II期，Gleason分级评分（Gleason grade score, GSS）以6和7为主；多数乳腺癌为I期，平均确诊年龄60.4岁。病例与对照按年龄、性别、采血时间、吸烟、饮酒等因素匹配，并随机划分发现集和留出测试集，以避免技术变异和混杂。
与偶发癌症相关的cfDNA差异甲基化区域富集于功能基因组元件
通过比较偶发癌症病例与性别匹配对照的全基因组差异甲基化，研究人员发现DMRs主要位于开放海区，CpG岛相对缺乏。DMRs在启动子、增强子或沉默子等调控元件及重复元件中显著富集，其中超甲基化区域富集于增强子、沉默子及长末端重复序列（long terminal repeats, LTRs）、短散在核元件（short interspersed nuclear elements, SINEs）和长散在核元件（long interspersed nuclear elements, LINEs）。转录因子结合位点富集分析显示，超甲基化区域富集于缺氧诱导转录因子（hypoxia-inducible transcription factors, HIFs）和ZFP57等甲基化敏感位点。基因集过表达分析（gene set overrepresentation analysis, GSOA）进一步显示，免疫相关过程及雌激素反应、P53、mTOR、MAPK、KRAS等细胞生长和存活通路显著富集。
诊断前癌症cfDNA差异甲基化区域捕获肿瘤组织基因组DNA甲基化模式
将诊断前血浆cfDNA DMRs与TCGA实体癌组织及PBLs的450k甲基化数据比较，研究人员发现前列腺癌cfDNA超甲基化开放海区与前列腺癌组织gDNA中超甲基化位点显著重叠；乳腺癌cfDNA中少数超甲基化CpG岛区域也可在肿瘤组织中检出。低甲基化cfDNA区域同样与多种实体癌组织gDNA低甲基化位点重叠。进一步利用77种细胞类型的全基因组亚硫酸盐测序（whole-genome bisulfite sequencing, WGBS）数据，发现乳腺癌cfDNA低甲基化区域富集于CD8
+ naive T细胞、CD8
+效应T细胞和B细胞特异性甲基化位点，而前列腺癌富集于CD4
+ T细胞特异性位点，提示cfDNA低甲基化可能反映特定免疫细胞比例或功能改变。
基于cfDNA甲基化沉默子区域预测前列腺癌未来风险
研究人员在发现集中使用前100个差异甲基化沉默子区域构建逻辑回归模型，交叉验证受试者工作特征曲线下面积（area under the receiver operating characteristic curve, AUROC）为0.78；在留出测试集中AUROC为0.73，且在诊断前5至8年的病例中达0.77。加权Kaplan-Meier分析显示，高风险评分四分
