miR-125a-5p通过负调控TRAF2抑制NF-κB通路减轻缺血性脑卒中大鼠炎症损伤的研究

《IBRO Neuroscience Reports》：miR-125a-5p inhibits NF-κB by negatively regulating TRAF2 to alleviate inflammatory injury in ischemic stroke rats

　　

某些miRNA的表达与缺血性脑卒中中的炎症和缺血再灌注（I/R）损伤显著相关。在本研究中，研究人员通过RNA测序鉴定了大脑皮层中的miR-125a-5p，发现其在炎症通路中显著富集。采用TTC染色、改良神经功能缺损评分（mNSS）和旷场实验评估脑梗死体积和神经功能缺损。利用尼氏染色和TUNEL实验检测皮层细胞凋亡。通过蛋白质印迹法（Western blot）和酶联免疫吸附测定（ELISA）检测大脑皮层中TRAF2、NIK和p-NFκB的水平，以及血清中肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1β（IL-1β）和干扰素-γ（IFN-γ）的浓度。研究发现，TRAF2作为miR-125a-5p的预测靶点，与NF-κB通路相关。过表达miR-125a-5p可减少脑梗死体积，抑制细胞凋亡和神经功能缺损，下调皮层中TRAF2、NIK和p-NF-κB的表达，并降低I/R大鼠血清中TNF-α、IL-1β和INF-γ的水平。miR-125a-5p通过负调控TRAF2，调节NF-κB通路，从而减轻炎症诱导的I/R损伤。

研究背景

缺血性脑卒中的发生主要由脑血管栓塞引起的脑缺血导致。近年来，脑卒中的致残率和死亡率显著上升。其病理生理机制复杂，涉及缺血再灌注（I/R）引起的神经元死亡、钙超载、氧自由基产生、炎性囊泡形成、炎症通路激活等多种分子调控机制。脑缺血区域的炎症反应会触发小胶质细胞、脑血管内皮细胞和星形胶质细胞的活化，进而产生炎性细胞因子和趋化因子。受影响的脑细胞迅速产生活性氧、促炎细胞因子如肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白细胞介素-1β（IL-1β）以及趋化因子，引发白细胞浸润和神经炎症。抑制这种炎症反应可能减轻缺血再灌注损伤。核因子kappa-B（NF-κB）等信号通路介导了炎症过程。研究表明，TNF受体相关因子2（TRAF2）在I/R损伤中通过调节NF-κB信号通路的激活发挥关键作用。然而，关于miR-125a-5p在脑I/R损伤中的作用及其潜在机制的研究有限，尚不明确。因此，本研究旨在探讨miR-125a-5p与TRAF2之间的潜在关联，并阐明miR-125a-5p通过NF-κB信号通路调控缺血性脑卒中炎症反应的机制。

研究方法与技术

研究人员从昆明医科大学实验动物中心获取成年雄性SD（Sprague-Dawley）大鼠，建立大脑中动脉栓塞/再灌注（MCAO/R）模型。采用miRNA测序进行差异表达分析及京都基因与基因组百科全书（KEGG）功能富集分析。通过逆转录定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）验证候选miRNA表达。使用慢病毒载体在大鼠皮层立体定向注射实现miR-125a-5p过表达。利用TTC染色评估脑梗死体积，尼氏染色、苏木精-伊红（HE）染色和TUNEL染色检测皮层组织病理变化和细胞凋亡。通过改良神经功能缺损评分（mNSS）和旷场实验评价神经功能和自发运动能力。采用酶联免疫吸附测定（ELISA）检测血清炎症因子水平，蛋白质印迹法（Western blot）检测皮层组织中TRAF2、NIK和p-NF-κB蛋白表达。此外，还培养了BV2小胶质细胞系并建立了氧糖剥夺/复灌（OGD/R）模型。

研究结果

1. 1.
   缺血性脑卒中大鼠差异表达miRNA的富集分析：与假手术组相比，缺血再灌注（IR）组共鉴定出264个差异表达的miRNA，其中137个上调，127个下调。KEGG富集分析显示这些miRNA的靶基因显著富集于NF-κB、Wnt、VEGF等炎症损伤相关信号通路和趋化因子通路。基于此，研究人员选择与I/R后炎症损伤密切相关的NF-κB信号通路进行深入研究。
2. 2.
   候选miRNA的验证：研究人员鉴定出6个显著富集于NF-κB信号通路的miRNA（miR-125a-5p、miR-212-3p、miR-351-5p、miR-504、miR-3085和miR-133c）。qRT-PCR验证结果与测序一致。通过TargetScan数据库预测miR-125a-5p的靶基因为TRAF2，该基因与NF-κB通路相关。在IR组大鼠脑组织和OGD/R组BV2细胞中，TRAF2表达显著上调，而miR-125a-5p表达显著下调。
3. 3.
   过表达miR-125a-5p减轻缺血性脑卒中大鼠I/R损伤：成功过表达miR-125a-5p后，与MCAO/R组相比，MCAO/R+up miR-125a-5p组大鼠的脑梗死面积显著减小，皮层中凋亡细胞数量减少，尼氏染色阳性细胞数量增多，表明过表达miR-125a-5p可减轻脑梗死和细胞凋亡。
4. 4.
   过表达miR-125a-5p促进缺血性脑卒中大鼠运动和神经功能恢复：与MCAO/R组相比，MCAO/R+up miR-125a-5p组大鼠在再灌注后第1、3、7天的运动距离显著增加，休息时间减少，mNSS评分降低，表明过表达miR-125a-5p改善了神经功能和自发运动能力。
5. 5.
   过表达miR-125a-5p抑制缺血性脑卒中大鼠炎症因子表达：与假手术组相比，MCAO/R组血清中TNF-α、IL-1β、干扰素-γ（INF-γ）和Caspase-8水平在再灌注后第1、3、7天均显著升高。与MCAO/R组相比，MCAO/R+up miR-125a-5p组上述炎症因子的血清水平显著降低。
6. 6.
   miR-125a-5p负调控缺血性脑卒中大鼠NF-κB信号通路：与假手术组相比，MCAO/R组大鼠脑组织中TRAF2、NIK和p-NF-κB蛋白表达在再灌注3天后显著升高。与MCAO/R组相比，MCAO/R+up miR-125a-5p组中这些蛋白的表达显著降低。这表明miR-125a-5p通过调节TRAF2表达来负调控NF-κB信号通路。

讨论与结论

讨论部分指出，I/R过程与氧化应激增加及促炎因子释放有关，会引发一系列病理级联反应，包括凋亡、血脑屏障破坏和脑水肿等。神经炎症机制在脑缺血急性期诱导神经元损伤中起重要作用，加剧了I/R损伤和神经功能缺损。抑制坏死性凋亡可显著减少缺血性脑卒中大鼠的脑梗死体积。一些miRNA能够激活或抑制炎症信号。本研究发现，过表达miR-125a-5p可显著降低缺血性脑卒中大鼠脑组织中TRAF2蛋白表达，并降低血清中TNF-α、IL-1β、INF-γ和Caspase-8等炎症相关因子的水平。TRAF2是TNF-α介导NF-κB激活所必需的，并介导来自TNF受体的抗凋亡信号。因此，miR-125a-5p可能通过负调控TRAF2，抑制NF-κB信号通路的激活，从而减轻缺血性脑卒中大鼠的脑炎症损伤。

研究结论为：上调miRNA-125可能通过负调控TRAF2，经由NF-κB信号通路减轻缺血性脑卒中大鼠的炎症和I/R损伤。