转谷氨酰胺酶催化谷氨酰胺修饰增强罗非鱼皮胶原蛋白肽抗冻活性：肽组学表征与分子对接

《Food Bioscience》：TGase-catalyzed glutamine modification enhances antifreeze activity of tilapia skin collagen peptides: peptidomics characterization and molecular docking

　　

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  酶修饰增强抗冻肽活性。
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  修饰肽CP-P₂的热滞后活性（THA）比TSCP-P₂高87.5%。
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  氢键可能是抑制冰晶生长的潜在因素。
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  CP-P₂中甘氨酸（Gly）、丝氨酸（Ser）、苏氨酸（Thr）和脯氨酸（Pro）的含量高于TSCP-P₂。

引言

冷冻通过抑制微生物生长和延缓化学反应来帮助保存食品，从而延长保质期（Banerjee & Maheswarappa, 2019; Ma et al., 2024）。然而，冷冻储存可能因冰晶生长、重结晶、蛋白质变性和氧化而导致品质下降（Xu et al., 2025）。为了减轻这些影响，开发安全高效的天热抗冻剂引起了越来越多的研究兴趣。传统商业抗冻剂（如糖类和磷酸盐）通过有效抑制冰晶生长和重结晶，同时减少蛋白质变性，表现出良好的抗冻效果（Liu et al., 2023）。然而，其高糖或高盐含量会带来健康风险，并可能对食品风味和质地产生不利影响，限制了其广泛应用（Uribarri et al., 2024; Zhang et al., 2024a）。源自天然蛋白质的抗冻肽（AFP）具有高效、安全和良好加工适应性等优势。近期研究报道了来自不同来源的AFP，如海参肠道（Xu et al., 2025）、蛇头鱼皮（Zhang et al., 2025）和牛明胶（Zhang et al., 2024b），展示了其在冷冻保护方面的潜力。

我们之前的研究表明，罗非鱼皮水解物中的AFP具有高热滞后活性（THA），并能有效保护冷冻扇贝肌肉（Cao et al., 2023a）。罗非鱼皮是水产加工中丰富的副产品，是含有固有抗冻潜力的胶原肽的有前景的来源。然而，天然罗非鱼皮胶原肽（TSCP）含有有限的具有明确抗冻活性的特异性序列，且其低提取率通常需要在实际应用中提高用量，增加成本并可能影响食品质地。提高TSCP的固有抗冻活性在科学和工业上都具有重要意义。

酶修饰可以改善肽的物理化学和生物学特性（Deng et al., 2025）。特别是，转谷氨酰胺酶（TGase）催化谷氨酰胺（Gln）残基的γ-羧酰胺基团与ε-氨基之间形成异肽键，从而实现肽链的交联（Zhang et al., 2022）。TGase介导的修饰已被证明能增强各种食品衍生肽的功能特性，如大豆蛋白分离物（Sun et al., 2023）和酪蛋白水解物（Wang et al., 2025）。在此基础上，我们的研究团队此前利用TGase将外源氨基酸偶联到TSCP上，获得了THA显著改善的偶联产物（CP）。在1%的添加量水平上，CP表现出与商业产品相当的抗冻效果；在2%时，则为罗非鱼鱼糜提供了最佳的冷冻保护（Ouyang et al., 2024）。然而，这些偶联产物的活性肽组分、结合位点和结构特征仍未被表征。了解这些特征可能有助于阐明活性增强的分子基础，支持设计更强的抗冻肽，并为评估此类修饰肽的潜力提供理论依据。

因此，本研究采用离子交换色谱法、傅里叶变换红外光谱法（FTIR）、液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）和分子对接技术，分离活性CP组分，分析其二级结构，鉴定肽序列，并研究肽与冰晶的相互作用。这些发现有望为开发高性能抗冻剂提供初步的理论见解，并为未充分利用的水产副产品的增值利用奠定基础。

各章节摘要

材料

TGase购自南宁庞博生物工程股份有限公司（中国南宁）；TSCP购自圣美诺生物科技有限公司（中国海口）；乙腈购自Fisher Chemical（美国沃尔瑟姆）；甲酸、碳酸氢铵、二硫苏糖醇和碘乙酰胺均购自Sigma-Aldrich（美国圣路易斯）；溴化钾（KBr）购自广州朗生物技术有限公司（中国广州）。

TGase催化偶联产物的制备

CP按照预优化的…制备

分离纯化结果分析

TSCP和CP分别用阴离子交换柱色谱法进行洗脱，使用Tris-HCl缓冲液（50 mmol/L，pH 8，含0–1 mol/L NaCl）。洗脱曲线如图1A和图1B所示。从CP中分离出两个明显的吸收峰，分别标记为CP-P₁和CP-P₂；从TSCP中分离出两个峰，分别为TSCP-P₁和TSCP-P₂。CP-P₁和TSCP-P₁峰出现在线性梯度洗脱阶段。随着Tris-HCl缓冲液中盐浓度的持续增加，the…

结论

利用阴离子交换柱色谱法，从CP中分离出CP-P₁和CP-P₂，从TSCP中分离出TSCP-P₁和TSCP-P₂。与未修饰的TSCP-P₂相比，CP-P₂表现出显著更高的THA。此外，其冰晶含量（Φ = 8.66%）明显低于TSCP-P₂（Φ = 46.46%）和未纯化的CP。这些结果表明，酶修饰与系统中THA的升高和冰晶含量的降低有关。FTIR分析表明，…

CRediT作者贡献声明

曹文红：撰写——审阅与编辑，监督指导，项目管理，经费获取。谭明堂：监督指导，软件，资源，调查。陈仲琴：监督指导，软件，调查，概念构思。欧阳吉瑾：撰写——初稿，资源，方法学，调查，数据整理。黄倩倩：撰写——初稿，可视化，验证，软件，方法学，数据整理，概念构思

利益冲突声明

作者声明不存在可能影响本文所报告工作的已知竞争性经济利益或个人关系。

数据可用性声明

数据应要求可提供。

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致谢

本工作得到深圳市自然科学基金的资助（JCYJ20220530162011026）。

黄倩倩|欧阳吉瑾|陈仲琴|谭明堂|曹文红