《Food Chemistry》：Sustainable utilization of rice wine cake: The integration of in vitro and in silico method for exploring antioxidant peptides
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摘要本研究对酒糟进行了可持续利用，以开发生物活性肽。在筛选的工业蛋白酶中，碱性蛋白酶表现出最优性能，其水解度（DH）最高（15%），<1 kDa的肽含量达77.4%，且其水解产物（APH）具有强效抗氧化活性。APH在氧化损伤的HaCaT细胞中将细胞内活性氧（ROS）降低了约5
摘要
本研究对酒糟进行了可持续利用，以开发生物活性肽。在筛选的工业蛋白酶中，碱性蛋白酶表现出最优性能，其水解度（DH）最高（15%），<1 kDa的肽含量达77.4%，且其水解产物（APH）具有强效抗氧化活性。APH在氧化损伤的HaCaT细胞中将细胞内活性氧（ROS）降低了约50%。通过Nano-LC-Q-Orbitrap质谱从APH中鉴定了703种肽，其中57.0%的低聚肽表现出末端两亲性。通过预测与Keap1的结合潜力，在结合能< ?7.0 kcal/mol的肽中，选取了末端具有两亲性的GLPPEWY、QHSIVATPF和WIDFPRAPQ，以及末端不具有两亲性的ATPFWQPATF和AAAPWPW，用于清除ROS。在50 μM浓度下，QHSIVATPF和ATPFWQPATF分别表现出最高（69.8%）和最低（40.1%）的ROS抑制率。分子动力学模拟很好地阐明了两者之间的机制差异。三种具有两亲性的肽被证实能促进核内Nrf2积累。这些发现表明末端两亲性对抗氧化肽具有重要意义。
引言
全球农业和食品加工业面临越来越大的压力，需要从线性、资源密集型模式向可持续的循环经济模式转变，对副产品进行高值化利用并减少废弃物（Ma等，2023）。对生物质废弃物的高值化利用可谓"一举两得"，既是一种社会责任，也是工业界新的盈利手段（Zheng等，2024）。在这一范式下，酒糟（中国又称酒糟或酒醪渣），作为传统黄酒发酵过程中产生的一种数量庞大且营养丰富的副产品，既带来了重大的处置挑战，也提供了难得的机遇。酒糟与白酒酒糟之间存在一些混淆。前者是在生产米制酒精饮料过程中经发酵和一次蒸馏后剩余的固体副产品，这意味着酒糟是一种富含蛋白质的物质。我们此前的测量表明，酒糟中含有丰富的蛋白质，占其湿重的24.4 ± 0.7%（Zhang等，2025）。其蛋白质组分富含赖氨酸和苏氨酸等必需氨基酸，以及酸性残基（谷氨酸和天冬氨酸）和疏水性氨基酸（亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸和苯丙氨酸），使得酒糟成为生产生物活性肽的理想原料（Chen等，2024）。而后者是在中国白酒（一种传统蒸馏酒）生产过程中，经过多轮发酵和蒸馏后剩余的固体副产品（在中国也被称为酒糟），这意味着该物质是一种富含未发酵物料（如纤维素）和少量蛋白质的残留物。因此，酒糟是一种值得高值化利用的宝贵副产品。令人遗憾的是，酒糟通常被低估为饲料等低价值产品。得益于绿色可持续技术的快速发展，尤其是生物技术在该领域的蓬勃兴起，在温和加工条件下且碳排放更少的情况下对酒糟进行高值化利用成为可能。
近年来，食品来源的生物活性肽因其安全性高、分子量低、成本低廉、生物活性强以及生物利用度良好而受到越来越多的关注（Reddy等，2012）。这一日益增长的关注推动了抗氧化肽的探索，这些肽能够保护皮肤细胞免受氧化应激的伤害。皮肤是人体的第一道防线，抵御病原体和水分过度流失。活性氧（ROS），如超氧阴离子、羟基自由基、过氧化氢和单线态氧，在皮肤老化过程中发挥着关键作用（Hensley & Floyd，2002）。环境胁迫和抗氧化防御能力下降导致皮肤细胞中ROS积累，引发氧化应激，损害核酸、蛋白质和脂质等生物分子，并导致胶原蛋白和线粒体功能恶化，最终加速皮肤老化（Kohen & Gati，2000；Sreedhar等，2020）。例如，从黄酒糟中提取的特定肽（如DNPNW和DPDGW）表现出强效的DPPH自由基清除活性，同时还具有鲜味特性（Zhang等，2024）。同样，对酒糟的研究鉴定出了新型抗氧化肽（包括AYI(L)和DREI(L)），这些肽对ABTS和DPPH自由基均表现出显著的自由基清除活性。细胞试验进一步揭示了它们在增强内源性抗氧化酶活性方面的效果，包括过氧化氢酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）（Jiang等，2020）。关于从白酒酒糟中获得的玉米醇溶蛋白可溶性肽（AAHVLAAAFL）的额外研究，通过湿法研磨与酶解联用工艺获得，表明其可能通过与关键调控蛋白相互作用来调节氧化应激的潜在机制（Liu等，2023）。总体而言，这些发现凸显了从酿造副产品中衍生的肽作为对抗氧化应激和延缓皮肤老化的天然物质的潜力。值得注意的是，即使在经过反复发酵和蒸馏后蛋白质含量相对较低的情况下，也在白酒酒糟中鉴定出了具有良好抗氧化功能的生物活性肽。然而，如此有限的蛋白质储量可能会限制这些肽的实际回收。因此，蛋白质含量更高的酒糟可能是通过酶解释放抗氧化肽更有前景的底物。
Keap1-Nrf2信号通路是细胞抗氧化防御的核心调控机制。在基础状态下，Keap1与转录因子Nrf2结合，促进其泛素化和蛋白酶体降解。在氧化应激条件下，Nrf2从Keap1上解离，转位至细胞核，并启动内源性抗氧化蛋白的转录，从而增强细胞的抗氧化能力（Dong等，2024）。近期研究表明，生物活性肽可以调节这一通路，激活Nrf2并促进抗氧化酶的表达，从而保护细胞免受氧化损伤（Lin等，2024）。因此，Keap1成为了挖掘抗氧化肽的特异性靶点。分子对接可作为一种强大的工具，用于高通量筛选潜在的抗氧化肽（Xie等，2022）。例如，蛋源抗氧化肽DKK和DDW就是通过分子对接从计算机构建的肽库中筛选出来的（Li等，2017）。然而，通过计算机构建的肽库通常无法通过实际酶解实现，这降低了该策略的应用前景。因此，干湿联合的方法，利用计算预测的效率和实验肽库构建的准确性，成为兼顾加速新型生物活性肽发现和实现肽实际产量的趋势（Xie等，2022）。与虚拟生成的肽库相比，使用实际酶解产生并通过质谱鉴定的肽库的策略与实际应用更为相关，因为所鉴定的肽是在真实酶解条件下实际产生的，因此更能代表最终水解产物的组成和潜在生物活性。
值得注意的是，在基于与Keap1对接筛选肽之后，大多数先前研究中选定肽的抗氧化活性评估通常依赖于自由基清除能力或相关抗氧化酶活性测定，虽然这些方法证实了肽的抗氧化活性，但未能提供其调节Keap1-Nrf2信号通路的直接证据（Chen等，2024；Li等，2017）。因此，体外检测如荧光偏振或检测细胞内Keap1-Nrf2信号通路将建立完整的证据链，证明选定的肽确实是Keap1抑制剂。此外，详细阐明构效关系以促进机制理解也是必要的。然而，分子对接主要提供静态结合信息。幸运的是，分子动力学（MD）模拟越来越多地被用于进一步评估肽-蛋白复合物的构象稳定性和其他动态特性（Mondal等，2022）。
本研究采用体外-计算机策略，对酒糟进行绿色可持续利用以开发生物活性肽。首先，比较了几种酶解方案，依据分子量分布的合理性和水解产物的潜在抗氧化活性。然后，通过质谱鉴定最优水解程序下产生的肽，构建实际肽库，随后进行分子对接预测与Keap1具有高亲和力的抗氧化候选肽。最后，通过氧化损伤HaCaT细胞中的细胞内ROS水平评估选定肽的抗氧化活性，并通过相关蛋白在mRNA和蛋白质水平上的表达验证其对Keap1-Nrf2信号通路的影响，从而提供连贯的证据链。此外，通过分子动力学模拟阐明了分子机制。
节选片段
材料
酒糟由上海崇明绿岛酿酒有限公司（上海，中国）提供。胃蛋白酶（≥ 400 NF·U/mg）、碱性蛋白酶（200 U/mg）、胰蛋白酶（250 U/mg）、木瓜蛋白酶（800 U/mg）、菠萝蛋白酶（600 U/mg）、中性蛋白酶（150 U/mg）均购自上海源叶生物科技有限公司（上海，中国）。胎牛血清（FBS）购自ExCell Bio（上海，中国）。BCA蛋白测定试剂盒、核蛋白提取试剂盒、总SOD、CAT、GSH-Px和MDA
酒糟酶解的蛋白酶选择
六种工业应用蛋白酶分解酒糟的水解度（DH）如图1a所示。胃蛋白酶和胰蛋白酶的水解效率最低，DH值分别为1.44%和2.77%，这与它们有限的切割位点一致（Rawlings等，2014）。具有更广切割位点的菠萝蛋白酶和木瓜蛋白酶（Rawlings等，2014）表现出更高的DH值，分别为3.08%和3.54%。中性蛋白酶也具有广泛的底物谱，达到了更高的DH值
结论
本研究建立了一种通过酶解酒糟生成抗氧化肽的绿色可持续高值化利用策略。碱性蛋白酶因其高的水解效率、高寡肽产率以及所产生水解产物在体外表现出的强抗氧化活性而被选中，包括自由基清除、增强细胞内抗氧化酶活性、减少脂质过氧化、稳定线粒体功能等。
CRediT作者贡献声明
张瑜之：撰写——初稿，方法论，数据整理，概念构思。陈佳雨：撰写——初稿，方法论，数据整理。赵汝昊：方法论，数据整理。罗锦南：方法论，数据整理。杜磊：撰写——审阅与编辑，方法论。赵丽：撰写——审阅与编辑，监督，形式分析。张杰：撰写——审阅与编辑，监督。谢景丽：撰写——审阅与编辑，监督，资源，获取资金。
利益冲突声明
作者声明不存在可能影响本文所述工作的已知竞争性经济利益或个人关系。
致谢
本工作受上海市农业科技自主创新计划（中国）资助（资助编号：202402080012F00030）。作者感谢华东理工大学分析测试中心和中国上海交通大学仪器分析中心的卓越协助。
张瑜之|陈佳雨|赵汝昊|罗锦南|杜磊|赵丽|张杰|谢景丽
