基于超plex PCR的法医 mRNA 细胞分型检测技术研究

《Forensic Science International: Genetics》：Hyperplex PCR for forensic mRNA-based cell typing

　　

摘要：鉴定体液或细胞类型可通过阐明证据与特定行为之间的关联，增强犯罪现场生物学斑迹的证据价值。通过mRNA分析研究基因表达是确定细胞类型的有效方法，这是因为某些基因在特定细胞中具有特异性表达。因此，需要一种能够快速分析涵盖所有相关细胞类型的大量mRNA标记且具有较大动态范围的方法。超plex PCR（hpPCR）是一种新技术，能够同时检测多达100个RNA或DNA靶标。本文描述了一种用于法医细胞类型确定的验证性hpPCR 17重mRNA检测方法的开发与评估。靶标和引物对选自基于毛细管电泳（CE）的CellTyper方法。该hpPCR检测包含血液、月经血、阴道黏膜、唾液、鼻腔分泌物和精液的标记物。在两个法医实验室中对所有这些细胞类型及其混合物的样本进行了分析。hpPCR mRNA检测检出了精液、血液、唾液、鼻腔分泌物和阴道分泌物的所有预期标记物。CellTyper显示了相似结果，但对阴道分泌物仅获得部分检出。总体而言，与CellTyper相比，hpPCR对预期标记物的检出能力相当或增强。在混合物中，hpPCR对精液少数成分的检出灵敏度较CellTyper略有提高，对阴道分泌物的检出能力与CellTyper相当。综上，hpPCR为基于mRNA的细胞类型鉴定提供了一种有前景的、可替代毛细管电泳和测序的方法。hpPCR检测方法的进一步开发可能包括为现有细胞类型或新细胞类型添加更多mRNA标记物，以及添加RNA-SNP以将mRNA结果关联至个体。

法医mRNA细胞分型研究：基于Hyperplex PCR的17重检测方法开发与评估

**1. 研究背景与意义**
在法医物证鉴定中，识别犯罪现场生物学斑迹的体液来源或细胞类型，能够阐明检材与特定犯罪行为之间的关联，从而显著增强证据价值。例如，控辩双方可能对嫌疑人的短串联重复序列（STR）分型匹配结果无异议，但对该斑迹与案件的相关性存在不同解释。因此，确定斑迹的体液或细胞类型可为法庭裁判提供关键信息。

目前，法医细胞分型主要基于mRNA表达分析，其原理在于某些基因在特定细胞中特异性表达。然而，现有方法存在一定局限：基于毛细管电泳（CE）的检测方法通量较低，动态范围有限；基于大规模平行测序（MPS）的方法虽可并行分析更多标记物，但成本高、耗时长。此外，常用的mRNA标记物可能在某些非靶组织中存在异位表达，例如阴道分泌物标记物MUC4常在鼻腔分泌物中被检出；而月经血样本中可能同时检出血液和阴道分泌物标记物。因此，亟需一种能够快速分析覆盖所有相关细胞类型的大量mRNA标记物、且具有较大动态范围的新方法。

Hyperplex PCR（hpPCR）是一种新兴技术，可同时检测多达100个RNA或DNA靶标，此前已应用于废水中SARS-CoV-2病毒变体RNA分析和作物基因表达检测。本研究旨在开发并评估一种基于hpPCR的17重mRNA检测方法，用于法医细胞类型鉴定，并与已建立的CE-based CellTyper方法进行直接比较。

**2. 研究设计与技术方法**
研究人员从基于CE的CellTyper方法中选取靶标和引物对，构建了包含血液、月经血、阴道黏膜、唾液、鼻腔分泌物和精液标记物的hpPCR 17重mRNA检测体系，同时包含两个参考基因（ACTB和18S-rRNA）。样本采集在两个法医实验室进行：实验室A收集了血液、月经血、阴道分泌物、唾液、鼻腔分泌物和精液样本（共8份），实验室B收集了上述类型及皮肤、直肠黏膜样本（共15份），并制备了多种体液混合物。RNA和DNA采用共提取方案（实验室A使用DNA IQ系统与ReliaPrep RNA细胞小提系统；实验室B使用mirVana miRNA分离试剂盒与QIAamp DNA迷你试剂盒）。hpPCR流程包括逆转录PCR（RT-PCR）扩增、锁式探针（padlock probe）连接、滚环扩增（RCA）、纳米像素标记和荧光显微镜成像五个步骤。CellTyper方法按已发表方案进行，采用多重PCR扩增和CE检测。研究在两个实验室中分析了单源样本、稀释样本、cDNA输入样本及混合样本，以100个RCA计数作为判定标记物明确检出的阈值。

**3. 研究结果**

**3.1 单源样本的hpPCR mRNA检测性能**
在实验室A的初步测试中，hpPCR检测方法对血液、月经血、阴道分泌物、唾液、鼻腔分泌物和精液的所有生物学和技术重复几乎均检出了全部预期细胞类型标记物，RCA计数几乎均超过100。两个参考基因在所有样本中均获得高RCA计数（约1000至超过300000）。基因组DNA对照和无模板对照仅在个别标记物出现低RCA计数的零星检出。在实验室B的进一步测试中，除月经血样本缺失ALAS2标记物外，所有测试细胞类型均实现了预期标记物的完全检出。将RNA提取物稀释25倍后，除阴道分泌物和月经血外，其余细胞类型的标记物检测仍能保持，但非靶标细胞类型标记物的检出数量显著降低，表明这些非预期标记物的RNA水平远低于靶标标记物。使用cDNA作为模板时，hpPCR的检出结果与RNA模板相似，但阴道分泌物样本的三个预期标记物检出很少或无检出，这可能是由于模板绝对量较低所致。

**3.2 hpPCR mRNA检测与CellTyper的比较**
对于精液、血液、唾液和鼻腔分泌物，hpPCR和CellTyper均检出了全部预期标记物（RCA计数>100）。对于阴道黏膜样本，hpPCR检出了全部三个阴道标记物，而CellTyper仅检出两个（使用较高cDNA输入量时可检出CYP2B7P1）。对于月经血样本，hpPCR检出了全部三个月经血和阴道黏膜标记物，以及三个血液标记物中的两个（缺失ALAS2）；CellTyper也检出了三个阴道黏膜标记物，但仅检出月经血和血液标记物各一个。总体而言，hpPCR对预期标记物的检出能力等同于或优于CellTyper。在非靶标细胞类型标记物方面，hpPCR检出的数量略多于CellTyper，但所有被CellTyper检出的非预期标记物（如月经样本中的STATH、唾液样本中的CD93和MUC4、鼻腔样本中的MUC4）均能被hpPCR检出，表明这些RNA确实存在于样本中。hpPCR检出更多非预期标记物与其对预期标记物更灵敏的检出相关联，两者均归因于hpPCR对样本中任何RNA的检测灵敏度更高。此外，皮肤和直肠黏膜样本在hpPCR中缺乏专属标记物，但检测到血液、阴道分泌物和月经分泌物的标记物，与CellTyper结果模式相似，说明这些标记物的检出源于样本中真实存在的RNA而非技术问题。

**3.3 体液混合物检测**
使用hpPCR，单源样本中检出的所有预期标记物在混合物中同样可被检出。在精液与月经血混合物（1:4比例）中，hpPCR检出了STATH而CellTyper未检出；在阴道分泌物与血液混合物（1:4）中，hpPCR检出了全部三个月经分泌物标记物，而CellTyper仅检出一个。对于混合物中的精液标记物KLK3和SEMG1，hpPCR的检出能力优于CellTyper。总体而言，与CellTyper相比，hpPCR对混合物中精液少数成分的检出灵敏度略有提高，对阴道分泌物（1:4比例）的检出能力相当。

**4. 讨论**
部分样本中非靶标细胞类型标记物的出现，可用基因在其他细胞中的异位表达或采样过程中的RNA转移来解释。样本稀释后非预期标记物检出显著减少，表明这些标记物的RNA含量低于靶标标记物。高度细胞特异性的标记物如PRM1（精子）、ALAS2（红细胞）和HTN3（唾液）几乎只在靶细胞类型中检出，而已知特异性较弱的标记物如MUC4（黏膜相关）则出现在其他组织类型中。月经分泌物中检出阴道标记物、鼻腔分泌物中检出唾液标记物，被认为与基因共表达和采样混合有关。因此，非预期标记物的出现源于生物学或采样因素，而非交叉反应或污染。这一现象与既往基于CE或测序的mRNA研究结果一致。

在引入实际案件应用前，需为hpPCR mRNA检测确定最佳检出阈值（如基于似然比（LR）的系统）。本研究采用100个RCA计数作为阈值，但较低计数也被报告以提供完整信息。由于CellTyper使用400 RFU的阈值，这也是hpPCR检出更多非预期标记物的原因之一。hpPCR检测可直接使用RNA或cDNA作为模板，cDNA模板的检出性能略低可能源于模板绝对量差异。与需要针对不同样本类型调整多个cDNA输入量的CellTyper不同，hpPCR的大动态范围免除了运行多个样本体积的需求。hpPCR的多重检测能力可扩展至100个标记物，为添加新标记物或RNA-SNP（用于关联个体身份）提供了可能。此外，hpPCR可并行检测RNA和DNA，未来可加入含内含子序列的DNA特异性标记物以检测残留DNA。本研究的局限性在于供体数量较少，未来需开展更大样本量的研究以建立阈值和确定最佳输入量及稀释度，并考察检出限和RT-PCR抑制剂耐受性等关键特性。

**5. 研究结论**
HpPCR为基于mRNA的细胞类型鉴定提供了一种有前景的可替代毛细管电泳和测序的方法。所开发的hpPCR检测方法对所有测试细胞类型的检出水平均等同于或优于已建立的CellTyper方法，这一结论同样适用于单源样本和不同体液混合物。hpPCR分析可使用mRNA或cDNA作为模板。该检测方法的进一步开发可能包括为现有细胞类型或新细胞类型添加更多mRNA标记物，以及添加RNA-SNP以将mRNA结果关联至个体。