环境6PPD暴露对多鳞白甲鱼（Onychostoma macrolepis）的生态毒性：水-肠道微生物关联框架

《Environmental Chemistry and Ecotoxicology》：The ecotoxicity of environmental 6PPD exposure to Onychostoma macrolepis: A correlative water–gut microbial framework

　　

N-(1,3-二甲基丁基)-N'-苯基对苯二胺（6PPD）是一种广泛使用的轮胎橡胶抗降解剂，其在 roadway 环境中可通过臭氧化转化为6PPD-醌（6PPD-Q），该转化产物因广泛存在而日益引发环境关注。6PPD及其醌类转化产物已在城市径流和受道路影响的收纳水体中被频繁检出。一项具有里程碑意义的研究鉴定出6PPD-Q是导致银大麻哈鱼（Oncorhynchus kisutch）在城市暴雨径流中急性死亡的主要因果毒物。研究人员在渭河沿程7个采样点均检出母体6PPD，浓度范围为1.01–19.82 ng/L，其中西安市下游的R5点位浓度最高。实验室控制暴露实验中，研究人员以0、1和10 μg/L的名义浓度对多鳞白甲鱼（Onychostoma macrolepis）和斑马鱼（Danio rerio）进行了为期30天的暴露处理，评估了生长指标、肠道组织病理学、氧化应激生物标志物及肠道微生物群落响应。结果显示，6PPD暴露诱导了两种鱼的肠道组织损伤、氧化应激反应（羟自由基清除能力下降、谷胱甘肽降低、丙二醛升高）以及肠道微生物群落结构改变。基于Onychostoma macrolepis暴露体系的SourceTracker分析表明，10 μg/L处理组中养殖水体微生物对肠道微生物群落的估计贡献率最高（81.4%–96.6%），提示水-肠道微生物群落组成相似性增加。在自然水体中，黄杆菌属（Flavobacterium）相对丰度与实测6PPD浓度呈最强的正相关（Spearman's ρ = 0.9286），且在分别调整总氮、总磷、氨氮、电导率、pH和溶解氧等协变量后关联仍具统计显著性。综合以上结果，研究人员提出了一种水-肠道微生物关联框架用于6PPD生态毒性评估，并支持Flavobacterium作为6PPD污染的潜在微生物生物标志物。该研究为理解轮胎来源新兴污染物在内陆河流生态系统中的生态效应提供了本地鱼类物种的毒理学证据。

**论文解读：环境6PPD暴露对多鳞白甲鱼的生态毒性——水–肠道微生物关联框架**

**一、研究背景与科学问题**

N-(1,3-二甲基丁基)-N'-苯基对苯二胺（6PPD）是轮胎橡胶中广泛使用的防降解剂，其在道路环境中经臭氧化可转化为6PPD-醌（6PPD-Q），该转化产物已被鉴定为导致银大麻哈鱼（Oncorhynchus kisutch）在 urban stormwater 中急性死亡的主要因果毒物，由此将轮胎来源转化产物提升为重大生态关注污染物。已有浓度数据显示，6PPD 在多个受交通影响的水体介质中广泛存在，检出范围涵盖 ng/L 至 μg/L 量级，包括香港城市径流（0.21–2.71 μg/L）、珠三角道路径流（0.19–7.52 ng/L）以及加拿大寒冷地区城市雨水（高达 1400 ng/L）。然而，针对内陆河流系统中本土鱼类的毒理学证据仍十分有限。已有斑马鱼（Danio rerio）研究表明，6PPD 及相关污染物可诱导发育毒性、损害肠道结构并促进氧化应激、改变肠道微生物组成、破坏肠-肝稳态，并通过多种机制引起慢性毒性。但污染河流中本土鱼类的可比毒理学证据仍然缺乏。肠道微生物组在鱼类营养、免疫调节和生理稳态中发挥重要作用，且栖息地相关的环境微生物库可参与鱼类肠道微生物群落的组装和重构。多鳞白甲鱼（Onychostoma macrolepis）是中国北方的一种本土鲤科鱼类，被列入《中国脊椎动物红色名录》易危等级，其作为内陆河流系统的本土驻留鱼类，可为评估栖息地污染物胁迫提供区域性相关证据。因此，研究人员开展了野外采样与实验室控制暴露相结合的研究，旨在：（1）表征多鳞白甲鱼自然栖息地水体中母体6PPD及相关微生物群落的存在特征；（2）评估6PPD处理对两种鱼的生长相关终点、肠道组织病理、氧化应激生物标志物和肠道微生物响应的影响；（3）检验养殖水与肠道微生物群落之间的相关性关系；（4）探究黄杆菌属（Flavobacterium）是否可作为与野外6PPD污染相关的潜在微生物生物标志物。该论文发表于《Environmental Chemistry and Ecotoxicology》。

**二、主要技术方法**

研究人员沿渭河陕西段设置7个采样点（上游R1–R2、城市影响中游R3–R5、下游R6–R7），于2025年4月采集水样。6PPD测定采用 QuEChERS 前处理结合液相色谱-串联质谱法（LC–MS/MS）。实验室暴露实验中，以多鳞白甲鱼（5月龄，购自陕西柞水绿野生态农业公司）和斑马鱼（野生型AB品系，4月龄）为受试生物，分别设置0、1、10 μg/L名义浓度处理组，每组3个独立养殖缸（每缸25尾鱼），半静态暴露30天。检测指标包括：生长指标（体长、体重、条件因子）、肠道组织病理学（H&E染色）、氧化应激指标（羟自由基清除能力、谷胱甘肽、丙二醛）、肠道及水体微生物群落（16S rRNA基因V3–V4区扩增子测序）、菌属绝对定量（qPCR）。此外还采集了各采样点的自然水体微生物样本。生物信息学分析采用QIIME 2、PICRUSt2功能预测、SourceTracker来源追踪、ALDEx2组成感知分析等方法。

**三、研究结果**

**3.1 渭河水体6PPD环境赋存特征**

6PPD在渭河全部7个采样点均被检出，浓度范围为1.01–19.82 ng/L，检出频率为100%。最高浓度出现在西安市下游的R5点位（19.82 ng/L），最低浓度出现在宝鸡市上游的R1点位（1.01 ng/L）。位于西安市附近的R3、R4和R5点位浓度均高于10 ng/L，表明城市交通源对河流6PPD污染具有显著贡献。

**3.2 养殖水体终点残留浓度**

在暴露实验终点，养殖水体中母体6PPD残留浓度低于对应名义浓度：斑马鱼Z1组为0.52 μg/L、Z10组为4.84 μg/L；多鳞白甲鱼L1组为0.68 μg/L、L10组为3.48 μg/L，表明暴露期间存在转化、吸附、生物吸收等损耗过程。

**3.3 6PPD处理对生长指标的影响**

30天暴露后，两种鱼的体长在各处理组间均无显著差异。多鳞白甲鱼10 μg/L处理组的体重和条件因子较对照组显著降低，而斑马鱼的相应指标与对照组无显著差异，提示多鳞白甲鱼对6PPD的生长相关响应更为敏感。

**3.4 肠道组织病理学改变**

组织学检查显示，10 μg/L处理组中两种鱼均出现绒毛变短、绒毛宽度增加和肌肉层厚度减少。定量分析表明，两种鱼10 μg/L组的绒毛高度均显著降低（P < 0.0001）。多鳞白甲鱼10 μg/L组的杯状细胞大小显著增加，而斑马鱼无显著变化。10 μg/L处理组还观察到上皮侵蚀和绒毛结构扩张。

**3.5 肠道氧化应激响应**

6PPD暴露显著影响了两种鱼肠道的氧化应激参数。随暴露浓度升高，羟自由基清除能力显著下降（P < 0.01），谷胱甘肽（GSH）水平降低（P < 0.01），丙二醛（MDA）水平升高（P < 0.01）。在10 μg/L处理组中，多鳞白甲鱼的羟自由基清除能力较对照组下降约40%，斑马鱼下降约25%。

**3.6 肠道微生物群落改变**

α多样性分析显示，斑马鱼肠道微生物Shannon和Simpson指数在各处理组间无显著差异；多鳞白甲鱼和养殖水体的α多样性在10 μg/L水平呈下降趋势。PCoA分析和PERMANOVA检验表明，两种鱼的肠道微生物和养殖水体微生物群落在各组间均存在显著的群落组成差异。门水平上，变形菌门（Proteobacteria）和厚壁菌门（Firmicutes）是两种鱼肠道的优势菌门，而养殖水体以变形菌门和拟杆菌门（Bacteroidota）为主。属水平上，气单胞菌属（Aeromonas）和无色杆菌属（Achromobacter）在两种鱼中均表现出处理相关的丰度变化。ALDEx2组成感知分析未发现BH-FDR < 0.05的显著差异菌属。属特异性qPCR绝对定量显示，两种鱼10 μg/L处理组中Aeromonas绝对丰度均显著高于对照组；多鳞白甲鱼暴露组中Achromobacter绝对丰度显著低于对照组。PICRUSt2功能预测显示，斑马鱼10 μg/L组中"类胡萝卜素生物合成"、"凋亡—多物种"和"肌醇磷酸代谢"通路预测下调；多鳞白甲鱼中"脂肪酸代谢"和"ABC转运蛋白"通路预测下调，而"次级代谢产物生物合成"预测上调。

**3.7 SourceTracker水-肠道微生物贡献分析**

以多鳞白甲鱼暴露体系为对象，SourceTracker分析估计对应养殖水体微生物对肠道微生物群落的贡献率：对照组为11.1%–41.6%，1 μg/L组为20.2%–69.1%，10 μg/L组为81.4%–96.6%。10 μg/L组中较高的估计贡献率表明该处理组中养殖水体与肠道微生物群落之间的组成相似性显著增强。

**3.8 自然水体微生物群落特征**

自然水体样品在ASV水平上的Venn图显示，7个采样点共有112个共享特征。城市影响河段点位R3–R5（实测6PPD > 10 ng/L）的α多样性低于其他多个点位。PCoA分析显示各采样点间微生物群落明显分离，ANOSIM检验证实点位间差异显著（R = 0.9294, P = 0.001）。LEfSe分析鉴定出各点位特征性富集类群，R3–R5点位中拟杆菌门相对丰度较高。

**3.9 黄杆菌属作为6PPD污染潜在微生物生物标志物的评估**

在受控暴露数据集中，Lactonifactor在斑马鱼肠道中与名义6PPD浓度呈负相关，Aeromonas在多鳞甲鱼肠道中呈正相关，Polynucleobacter在养殖水体中呈正相关。在自然水体数据集中，以采样点为独立生态单元，黄杆菌属（Flavobacterium）相对丰度与实测母体6PPD浓度呈最强且最一致的正相关（Spearman's ρ = 0.9286，精确置换检验P = 0.00675，n = 7个点位）。在分别调整总氮、总磷、氨氮、电导率、pH和溶解氧后，该正相关关系仍具有统计显著性（BH-FDR q < 0.05）；调整水温或粗略城市影响河段分类后关联有所减弱但仍保持正值。相比之下，假单胞菌属（Pseudomonas）、不动杆菌属（Acinetobacter）和气单胞菌属在自然水体中虽拟合斜率为正，但Spearman相关性均未达到统计显著性。

**四、讨论总结与结论**

讨论部分指出，渭河6PPD浓度处于受交通影响水体的低ng/L范围内，采样点均位于靠近堤岸道路的受交通影响河段，道路径流输入是6PPD进入水体的可能途径。名义暴露浓度（1和10 μg/L）高于实测环境浓度，用于表征处理相关的生物学响应而非模拟野外等价暴露水平。两种鱼在适宜各自物种的饲养条件下表现出物种特异性响应模式，这种差异可能源于维持温度、起源、发育历史、驯化过程及终点残留浓度的不同，而非简单的种间敏感性排序。关于水–肠道微生物关联框架，10 μg/L处理组中水体微生物对肠道微生物群落的估计贡献率最高，提示6PPD暴露可能增强水体与肠道微生物群落的组成相似性，但SourceTracker分析基于群落相似性估计潜在来源贡献，不直接证明转移方向或定植成功。关于肠道损伤机制，绒毛高度降低表明肠道吸收表面积减少，PICRUSt2预测的"脂肪酸代谢"和"ABC转运蛋白"通路下调与组织病理学和氧化应激响应一致，但这些通路变化系基于1S rRNA的功能预测而非直接测量，需谨慎解读。关于Flavobacterium作为生物标志物的潜力，该菌属在淡水中广泛分布，已有研究在多瑙河和巢湖周边河流中发现其具有生物指示潜力。本研究中Flavobacterium相对丰度与6PPD浓度在点位层面呈稳健正相关，且在校正多项环境协变量后关联仍显著，支持其作为与6PPD污染相关的潜在微生物生物标志物；但该关联不应解释为Flavobacterium对6PPD具有排他性或因果性响应，尚需跨季节、跨流域研究和多污染物共暴露实验来验证其敏感性、特异性和预测性能。

研究结论可翻译为：母体6PPD在渭河沿程全部7个采样点均被检出，浓度范围1.01–19.82 ng/L，证实了该内陆河流系统中存在此类轮胎来源污染物，且该河流栖息着本土鲤科鱼类多鳞白甲鱼。在为期30天的1和10 μg/L名义浓度6PPD暴露后，多鳞白甲鱼和斑马鱼均表现出肠道组织病理学改变、氧化应激响应以及肠道微生物群落的结构重构。多鳞白甲鱼10 μg/L处理组的体重和条件因子亦有所降低。属特异性qPCR证明两种鱼10 μg/L处理组中气单胞菌属绝对丰度增加，而多鳞白甲鱼暴露组中无色杆菌属丰度降低。在养殖水体中，Polynucleobacter呈现处理相关的正向模式，SourceTracker分析表明10 μg/L处理组中养殖水体与肠道微生物群落的组成相似性增加。在自然河水体中，各采样点微生物群落差异显著，黄杆菌属在所筛查菌属中与实测6PPD浓度呈现最强的点位层面正相关。该关联在分别校正多个环境协变量后仍保持显著，支持黄杆菌属作为与6PPD污染相关的潜在微生物生物标志物。气单胞菌属、无色杆菌属、Polynucleobacter和黄杆菌属的响应共同揭示了跨越鱼肠、养殖水体和自然河流环境的区室特异性但互补的微生物特征。这些发现支持一个用于理解6PPD生态效应的水–肠道微生物关联框架，并强调了将本土鱼类纳入新兴轮胎来源污染物评估的重要性。