《Current Research in Food Science》：Analysis of novel umami peptides in Dengchuan beef and their taste mechanism: Integrated peptidomics, machine learning and molecular simulation studies
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本研究通过肽组学结合分子模拟技术，揭示了邓川牛肉（Dengchuan beef, DB）中的鲜味肽及其鲜味机制。研究人员利用液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）共鉴定出4,220条肽序列，并通过虚拟筛选获得五个新型鲜味肽（ER-10、GK-10、DR-11、
本研究通过肽组学结合分子模拟技术，揭示了邓川牛肉（Dengchuan beef, DB）中的鲜味肽及其鲜味机制。研究人员利用液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）共鉴定出4,220条肽序列，并通过虚拟筛选获得五个新型鲜味肽（ER-10、GK-10、DR-11、EA-11和HY-12）。感官评价与电子舌分析确认了这些肽的鲜味特性，其中ER-10和DR-11表现出显著的鲜味增强效应。分子模拟结果揭示，Lys155、Gln52、Ser109、Ser216、Arg255、Ser217和Met151被认定为五个肽与T1R1/T1R3受体稳定结合的关键残基。在这些相互作用中，氢键作用占据主导地位，其次为疏水相互作用和静电相互作用。值得注意的是，Arg、Phe、Trp和Lys等残基被认为是肽类鲜味活性的关键贡献因素。本研究为肉类来源鲜味肽的构效关系研究提供了新的见解。
**一、研究背景与科学问题**
鲜味是食品质量评价中的重要指标，赋予食物特征性的鲜美口感。食品中的主要鲜味物质包括鲜味氨基酸、有机酸、核苷酸及鲜味肽。近年来，鲜味肽作为一种新型、天然、营养且安全的鲜味物质受到广泛关注，已成为揭示食品鲜美滋味的重要代表物质。目前，已从鸡肉、鱼肉、鹅肉等多种肉类蛋白中提取出200余种新型鲜味肽，这些鲜味肽不仅自身呈现鲜味，还能与谷氨酸钠（MSG）或氯化钠溶液协同增强鲜味和咸味。然而，现有研究主要集中于短链肽（通常少于10个氨基酸），长链鲜味肽独特的味觉特征及其潜在意义尚未被充分探索。传统鲜味肽分离鉴定方法如超滤（UF）、凝胶过滤色谱（GFC）和反相高效液相色谱（RP-HPLC）虽具有较高准确性，但耗时费力、成本高昂，且存在丢失部分理想风味特征肽段的风险。近年来，肽组学与机器学习预测分析的结合已成为快速筛选和鉴定鲜味肽的可靠技术，分子模拟技术也被用于揭示鲜味受体T1R1/T1R3与鲜味肽之间的相互作用机制。然而，现有计算模型和筛选策略多针对短序列优化，难以准确捕捉长链肽复杂的构象折叠和多位点动态结合特征，导致其独特的受体激活模式仍不清楚。牛肉作为全球消费最广泛的肉类之一，是重要的鲜味肽来源。邓川牛肉（DB）产自云南，具有良好的嫩度、熟肉率和鲜美汤味，但导致其特征鲜味的关键肽类贡献者尚不明确。本研究旨在从DB中挖掘新型鲜味肽并阐明其呈味机制。
**二、研究内容与总体结论**
研究人员以DB为原料，采用整合肽组学、基于机器学习的预测和分子对接策略筛选具有潜在鲜味活性的肽段，合成目标肽段后利用感官分析和电子舌测量评估其味觉特征（包括鲜味强度、感官阈值和鲜味增强效应），并通过分子对接和动力学模拟研究肽与T1R1/T1R3鲜味受体的相互作用。研究共鉴定出4,220条肽序列，筛选获得五个新型鲜味肽（ER-10、GK-10、DR-11、EA-11和HY-12），确认了其鲜味特性并揭示了其与受体的结合机制。该研究推进了对鲜味肽构效关系的理解，为开发牛肉源鲜味肽提供了理论基础。
**三、主要关键技术方法**
研究人员主要运用了以下关键技术方法：首先利用超滤技术按分子量分级DB水提物，结合液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）进行肽段鉴定；采用三种机器学习模型（iUmami_SCM、Umami_YYDS和Tastepeptides_DM）整合筛选鲜味肽，并通过ToxinPred等工具评估肽段的水溶性和毒性；运用同源建模构建T1R1/T1R3和代谢型谷氨酸受体4（mGluR4）三维结构，采用AutoDock Vina进行分子对接；利用傅里叶变换红外光谱（FTIR）分析肽段二级结构；最后采用AMBER 22软件包进行100 ns分子动力学（MD）模拟，并通过MM-GBSA方法计算结合自由能。样本来源于云南省大理一品高原农业有限公司屠宰的27月龄雄性DB，新鲜牛肉经48小时低温排酸后于0-4°C无菌密封袋中运输至实验室，-18°C保存。
**四、研究结果**
**1. DB水提物的味觉特征与肽谱分析。** 感官评价结果显示，UF1（<3 kDa）组分的鲜味评分（7.09）显著高于UF2（3-5 kDa）和UF3（>5 kDa），表明低分子量肽段具有最强的鲜味强度。LC-MS/MS共鉴定出4,220条可信度评分>50的肽段，其中1,854条肽分子量低于1.5 kDa，占肽段总数的43.93%。氨基酸组成分析显示，N端以Ala、Asp、Glu等残基为主，C端以Arg、Lys、Asn和Leu为主，共899条肽在C端含有Lys、Leu、Thr和Arg，其中65条肽同时具有N端Glu和C端Lys、Leu、Thr、Arg，这是增强鲜味的已知理化特征。此外，143条肽的鲜味氨基酸（D/E）比例≥30%。
**2. 鲜味肽的筛选。** 通过三种机器学习模型整合筛选，从143条初始肽中获得98条具有优良鲜味潜力的肽段，进一步采用iUmami_SCM>650的严格阈值筛选获得23条肽段。毒性预测排除1条有毒肽段（AEEEYPDLSKHN），剩余22条肽段均为无毒且水溶性良好。分子对接分析显示，22条肽与T1R1/T1R3受体的对接能介于-9.5至-6.3 kcal/mol之间，其中ER-10、GK-10、DR-11、EA-11和HY-12五个肽段具有特别低的结合能（<-8 kcal/mol），表明其与受体可形成稳定的复合物结构。
**3. 五个鲜味肽的味觉特征。** 感官评价显示五个肽段呈现不同的鲜味强度，其中ER-10鲜味最强，这可能与其最高的鲜味活性片段和最低的结合能有关。味觉稀释分析（TDA）测定ER-10、HY-12、GK-10、DR-11和EA-11的鲜味阈值分别为0.0625、0.125、0.25、0.125和0.25 mg/mL，均低于MSG的阈值（0.3 mg/mL），表明五个肽段具有良好的鲜味。鲜味增强实验显示，ER-10、GK-10、DR-11、EA-11和HY-12分别使0.35% MSG溶液的鲜味评分提高36.00%、8.82%、28.57%、12.12%和20.69%，其中ER-10和DR-11表现出最强的协同增效作用。电子舌分析验证了感官评价结果，值得注意的是HY-12在电子舌检测中鲜味强度最低，但鲜味回味最强，表明其具有良好的鲜味持续性。
**4. 鲜味肽的构效关系。** FTIR分析显示五个肽段在固态下的二级结构包括α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规则卷曲，其中β-转角和无规则卷曲是最丰富的结构。DR-11的β-转角含量最高（51.79%），表明其构象稳定性最佳。研究推测β-转角和无规则卷曲结构可能是维持肽段结构稳定性和产生鲜味的主要贡献因素。
**5. 鲜味肽与T1R1/T1R3受体的结合机制。** 表面力分析显示氢键、芳香相互作用、亲水性和溶剂可及表面积是影响五个鲜味肽与T1R1/T1R3受体结合的关键因素。分子对接结果显示五个肽段分别与受体形成20、10、16、28和15个氢键，表明氢键在肽-受体稳定结合中起主导作用，其次为静电相互作用和疏水相互作用。ER-10中的Trp残基与受体形成7个疏水相互作用，这可能是其鲜味强度最高且结合能最低的原因。十一个氨基酸残基（包括Asp108、Ser109、Asn150、Arg255、Gln221、Gln222等）表现出较高的相互作用频率，其中Asp108、Asn150、Gln221、Gln222和Ser217是最常参与相互作用的残基。
**6. 鲜味肽与mGluR4受体的结合机制。** 分子对接研究表明五个肽段与mGluR4受体的结合模式以极性相互作用为主、疏水相互作用为辅。ER-10与mGluR4形成的分子间氢键作用最为显著，而HY-12形成的疏水相互作用最强。五个肽段与mGluR4的结合能分别为-6.3、-5.8、-4.4、-5.6和-5.5 kcal/mol，绝对值显著低于与T1R1/T1R3的结合能，表明五个肽段的鲜味产生主要由T1R1/T1R3受体调控，mGluR4可能起辅助作用。
**7. 分子动力学模拟研究。** MD模拟结果显示，DR-11、ER-10、HY-12和GK-10在模拟过程中与T1R1/T1R3受体保持较高的结合稳定性，而EA-11的RMSD持续上升，结构不稳定性明显，这可能是其鲜味强度最低的原因。MM-GBSA计算表明五个肽段与受体的结合能分别为-66.92±5.18、-77.23±8.08、-63.88±4.78、-59.91±6.39和-53.67±9.53 kcal/mol，其中静电能量是主要贡献因素。氨基酸能量分解分析揭示Lys155、Gln52、Ser109、Ser216、Arg255、Ser217和Met151是五个肽段与受体稳定结合的关键残基，而精氨酸（Arg）、苯丙氨酸（Phe）、色氨酸（Trp）和赖氨酸（Lys）是鲜味肽产生鲜味的重要氨基酸。
**五、总结讨论与研究结论**
本研究通过整合肽组学、机器学习预测和分子模拟技术，系统鉴定了DB中的鲜味肽并阐明了其呈味机制。研究发现五个长链鲜味肽（ER-10、GK-10、DR-11、EA-11和HY-12）具有良好的鲜味特性，其中ER-10和DR-11展现出最强的鲜味强度和鲜味增强效果。研究确认了氢键在肽-受体稳定结合中的主导作用，明确了T1R1/T1R3受体上的关键结合残基以及Arg、Phe、Trp和Lys等关键鲜味贡献氨基酸。该研究为揭示DB的特征鲜味提供了新的视角，为长链鲜味肽与T1R1/T1R3受体的相互作用机制提供了新的研究案例，也为肉类来源鲜味肽的构效关系研究奠定了理论基础。未来研究需进一步分析长链鲜味肽与其他鲜味成分的相互作用机制，拓宽鲜味肽的应用前景；同时，mGluR4受体也可能影响鲜味感知，对这些受体的深入分析将有助于更全面地理解鲜味肽识别与信号转导的分子机制。
