《Brain Research Bulletin》：PI3K/AKT signaling contributes to prenatal nicotine exposure-induced developmental impairment of the pontomedullary respiratory network in neonatal rats
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磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（PI3K/AKT）信号通路参与产前尼古丁暴露致新生大鼠延髓桥脑呼吸网络发育损伤。产前尼古丁暴露（PNE）损害延髓桥脑呼吸核团的神经元发育；PNE诱导呼吸相关核团凋亡及小胶质细胞激活；PNE激活PI3K/AKT信
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磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（PI3K/AKT）信号通路参与产前尼古丁暴露致新生大鼠延髓桥脑呼吸网络发育损伤。产前尼古丁暴露（PNE）损害延髓桥脑呼吸核团的神经元发育；PNE诱导呼吸相关核团凋亡及小胶质细胞激活；PNE激活PI3K/AKT信号通路；渥曼青霉素（Wortmannin）可减轻PNE诱导的凋亡及小胶质细胞激活；失调的PI3K/AKT信号通路参与PNE诱导的发育损伤。本研究探讨了PI3K/AKT信号通路在PNE致新生大鼠（出生后第2天，P2）延髓桥脑呼吸网络发育异常中的作用。研究人员进一步检测了PI3K/AKT抑制是否减轻PNE诱导的神经元发育损伤、神经元凋亡及小胶质细胞激活，从而为PNE干扰发育中呼吸控制网络的分子机制提供见解。
论文解读：
**研究背景与科学问题**
孕期吸烟和产前尼古丁暴露（prenatal nicotine exposure, PNE）是重要的公共健康问题。全球荟萃分析显示约1.7%的女性在孕期吸烟，高收入国家中约十分之一孕妇吸烟。尼古丁作为烟草的主要成瘾成分，可穿过胎盘并干扰胎儿脑发育。已有研究表明，PNE与子代呼吸控制功能受损相关，包括低氧和高碳酸血症通气反应改变、呼吸暂停易感性增加，以及孕期吸烟与婴儿猝死综合征风险升高有关。在神经环路层面，PNE可改变发育中呼吸环路内GABA能、烟碱能和谷氨酸能神经传递，进而影响呼吸节律产生和运动输出；在细胞层面，发育期尼古丁暴露与舌下运动神经元树突成熟受损相关。人类尸检研究亦发现，母亲吸烟与延髓桥脑呼吸网络多个组分发育不全相关，包括面神经核/旁面神经群（facial/parafacial complex）、K?lliker-Fuse核及前包钦格复合体（pre-B?tzinger complex, pre-B?tC）。然而，这些神经发育和细胞改变背后的细胞内信号机制仍不清楚。磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（PI3K/AKT）信号通路在调控细胞生长、增殖、存活、代谢和凋亡中发挥关键作用，其适当活性对正常脑发育至关重要，失调则可导致多种神经发育异常。已有研究显示围产期尼古丁暴露可改变新生鼠脑内AKT相关信号，且PNE可减弱低氧诱导的尾侧脑干中PDGFR、AKT和BAD磷酸化并加速凋亡信号。然而，在基础发育条件下、不依赖低氧刺激时，PI3K/AKT信号是否参与PNE诱导的延髓桥脑呼吸网络发育异常仍不清楚。因此，本研究旨在探讨PI3K/AKT信号在PNE致新生大鼠延髓桥脑呼吸网络发育异常中的作用，并检验PI3K/AKT抑制能否减轻PNE诱导的神经元发育损伤、凋亡及小胶质细胞激活。
**研究内容与主要结论**
研究人员建立产前尼古丁暴露大鼠模型，从妊娠第0天（G0）至第21天（G21）通过皮下植入渗透泵持续给予尼古丁（6 mg/kg/天），并在PNE+Wort和Wort组每日尾静脉注射PI3K抑制剂渥曼青霉素（Wortmannin, 15 μg/kg/天）。实验分为两部分：第一部分评估PNE诱导的形态学和PI3K/AKT信号改变；第二部分检验wortmannin干预对PNE诱导异常的影响。结果显示，PNE组新生大鼠（P2）延髓桥脑组织中可替宁（cotinine）浓度显著升高，证实产前尼古丁暴露成功。组织学检查（苏木精-伊红染色和尼氏染色）显示，PNE组面神经核（VIIn）、旁面神经呼吸群（pFRG）、舌下神经核（XIIn）、疑核（NA）和pre-B?tC区域出现细胞构筑边界不清、神经元胞体缩小、神经元固缩增多、神经元变性及小胶质样小深染细胞增多等形态学异常。Western blot检测显示，PNE组延髓桥脑组织中PIK3CA表达显著升高，p-AKT1/AKT1比值显著增大，凋亡相关蛋白caspase-3和caspase-9表达也显著上调。免疫组化结果显示，PNE组VIIn/pFRG、XIIn和NA/pre-B?tC区域NeuN阳性细胞百分比显著降低，TUNEL阳性细胞百分比显著增加，Iba-1阳性小胶质细胞百分比显著升高。给予wortmannin后，上述指标均得到显著改善：NeuN阳性细胞百分比回升，TUNEL阳性细胞减少，caspase-3和caspase-9表达降低，PIK3CA表达和p-AKT1/AKT1比值下降，Iba-1阳性细胞减少。此外，PNE还导致新生大鼠身体和脑生长受限，表现为体重和体长显著低于对照组，脑和延髓桥脑区域肉眼观较小；wortmannin处理部分逆转了这些生长受限。
**关键技术与方法**
本研究采用的关键技术方法包括：液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）定量检测延髓桥脑组织中可替宁浓度以验证暴露；Western blot检测PIK3CA、AKT1、p-AKT1、caspase-3和caspase-9蛋白表达；苏木精-伊红（H&E）染色和尼氏染色评估神经元形态；NeuN免疫组织化学标记成熟神经元；TUNEL染色检测凋亡细胞；Iba-1免疫组织化学标记小胶质细胞。实验使用SPF级Sprague-Dawley大鼠，妊娠大鼠随机分组，幼崽出生后标准化每窝8只。在P2时随机选取每窝5只测量体重和体长，每窝1只分别用于组织学和分子分析。
**研究结果分述**
**2.1 PNE诱导新生大鼠延髓桥脑呼吸网络神经元形态异常**：通过LC-MS/MS确认PNE组可替宁浓度显著升高；H&E和尼氏染色显示VIIn、pFRG、XIIn、NA和pre-B?tC区域出现神经元固缩、变性及小胶质样细胞增多，表明PNE破坏神经元形态发育。
**2.2 PNE改变延髓桥脑呼吸网络PI3K/AKT信号和凋亡相关蛋白表达**：Western blot显示PNE组PIK3CA表达显著升高，p-AKT1/AKT1比值增加，caspase-3和caspase-9水平升高，提示PNE激活PI3K/AKT通路并促进凋亡信号。
**2.3 PI3K/AKT抑制减轻PNE诱导的神经元发育损伤**：NeuN免疫组化显示PNE组上述区域神经元阳性率下降，wortmannin处理使NeuN阳性细胞百分比回升，说明抑制PI3K/AKT可部分逆转神经元发育损害。
**2.4 PI3K/AKT抑制减轻PNE诱导的凋亡**：TUNEL染色显示PNE组凋亡细胞比例显著增加，wortmannin处理后显著降低；Western blot进一步证实wortmannin降低PIK3CA表达、p-AKT1/AKT1比值及caspase-3和caspase-9水平，表明凋亡是失调PI3K/AKT信号导致发育损伤的机制之一。
**2.5 PI3K/AKT抑制减轻PNE诱导的小胶质细胞激活**：Iba-1免疫组化显示PNE组小胶质细胞阳性率显著升高，wortmannin处理后显著下降，提示小胶质细胞过度激活可能是另一个机制。
**2.6 PNE限制新生大鼠躯体生长并伴随脑生长减小**：母鼠孕期体重和产仔数无组间差异；PNE组P2幼鼠体重和体长显著降低，脑和延髓桥脑体积肉眼观较小；wortmannin部分逆转了PNE相关的生长限制。
**讨论与结论总结**
讨论部分指出，PNE诱导的延髓桥脑呼吸网络发育异常涉及多个核团，与既往人类和动物研究一致。本研究发现PNE增加PIK3CA表达和p-AKT1/AKT1比值，同时增加凋亡，但PI3K/AKT抑制可减少凋亡并恢复神经元数量。由于PI3K/AKT信号的作用具有环境依赖性，PNE可能在发育基础条件下以环境依赖性方式失调该通路，增强的途径活性可能促进神经元凋亡和发育损伤。同时，PNE增强小胶质细胞反应，而抑制PI3K/AKT可减轻该反应，提示失调的PI3K/AKT信号通过影响神经元存活和小胶质细胞激活共同参与PNE诱导的异常。研究还存在局限性：未直接评估功能呼吸结局；pFRG仅依据解剖标志定位而未使用Phox2b等分子标志确认；仅使用单一尼古丁剂量，缺少剂量-反应设计。研究结论为：PNE破坏新生大鼠延髓桥脑呼吸网络发育，失调的PI3K/AKT信号可能通过增强神经元凋亡和小胶质细胞激活参与该过程，为理解产前尼古丁诱导的呼吸网络异常机制提供了新见解。
